ゲノミクスを用いた自己免疫疾患の解明
研究者は、狼瘡やその他の自己免疫疾患に関連するバリアントを同定するためにWGSとWESを実施しています。
ゲノミクスを用いた自己免疫疾患の解明
はじめに
免疫システムは一見ミステリアスな方法で作用します。一方、私たちの体内の免疫細胞は、外来の侵入者と戦うようにプログラムされています。逆説的には、免疫細胞は正常細胞に逆向きになり、エイリアンや不慣れな細胞として扱われ、自己免疫疾患を引き起こすこともあります。
Carola Vinuesa医学博士は、ループスなどの自己免疫疾患に重点を置き、16年間にわたって免疫学的障害を研究してきました。サンガーシーケンスを用いて、免疫制御と免疫寛容に不可欠な遺伝子ファミリーを発見しました。RoquinとそのパラログであるRoquin 2. 1,2 オーストラリア国立大学のJohn Curtin School of Medical Researchの彼女と彼女の研究チームは、自己免疫の制御に関与するT細胞の2つの特定のファミリーに関して重要な発見をしました。T濾胞ヘルパー（Tfh）細胞、およびT濾胞制御性（Tfr）細胞。3–5
Vinuesa教授は、John Curtin School of Medical Researchの免疫学および感染症学科長です。また、Centre for Personalized Immunology（CPI）の共同ディレクターでもあります。CPIは、自己免疫の遺伝的原因を理解し、診断を精緻化し、治療を改善することを目的としています。彼女の目標は、次世代シーケンサー（NGS）などの遺伝子ツールを使用して、患者間の遺伝的差異を理解し、個人のゲノムに基づいて、より効果的で個別化された治療法を特定することです。
iCommunityはVinuesa教授と、ループス（全身性エリテマトーデス、SLEとも呼ばれます）やその他の自己免疫疾患の背景にある遺伝学を明らかにするためにHiSeq X TenおよびHiSeq 2500システムをどのように使用したか、また科学における男女平等を支援する取り組みについて話しました。
Carola Vinuesa医学博士は、オーストラリア国立大学ジョン・カーチン医学研究科の免疫学および感染症学科長であり、オーストラリアのキャンベラにある個別化免疫学センターの共同ディレクターです。
Q：自己免疫疾患の研究に興味を持ったきっかけは何ですか？
Carolyn Vinuesa（CV）：研究キャリアの初期に、私の主な関心事の1つは、体が産生する抗体の品質を制御する胚中心反応を理解することになりました。最も理解されていない質問の1つは、抗体産生中に品質管理がどのように失敗するか、そしてそれが私を惹きつけたことです。
最初のポスドクでは、どの遺伝子がループス様表現型を引き起こしているかを同定するために、化学的に（N-エチル-NニトロソウレアまたはENU）誘発性のマウス変異の大規模なスクリーニングプログラムを立ち上げ、新しい遺伝子ファミリーであるRoquinの発見につながりました。その結果、自己免疫疾患に関連するパスウェイを研究することができました。現在根治的な治療法がない臨床上の問題に関連する興味深い所見がいくつか得られました。しかし、ループスやその他の自己免疫疾患における臨床とパスウェイの非常に大きな不均一性を考えると、効果的な治療法を見つけるために、分子的または遺伝的な違いを特定し、欠陥のあるパスウェイに従って患者を層別化する必要があることが明らかになりました。
Q：NGSの前に、疾患に関連する遺伝子変異を同定するためにどのような細胞および分子生物学ツールを使用しましたか？
CV：従来のマッピング手法を用いてRoquinを同定しました。疾患の原因となる変異を持つマウスを、異なる遺伝的背景のマウスと交差させ、多型マーカーを使用して疾患に関連する領域を同定しました。ゲノムの1 Mb未満に間隔を狭めた後、個々のエクソンのサンガーシーケンスを実施しました。当時は知られていなかった遺伝子の変異であるRoquinを同定しました。
今回の研究結果をヒトの疾患に転換するため、オーストラリア全土の多くの臨床医の協力を得て、APOSLE（オーストラリアのSLEにおける点変異）コホートを立ち上げました。まず、候補遺伝子シーケンスを行い、Roquinおよび関連遺伝子の変異を同定しました。その技術の限界は、300人を超える被験者で個々の遺伝子の多くのエクソンをシーケンスする膨大な時間と労力でした。Roquin単独では20のエクソンがあります。そのため、多くの遺伝子をシーケンスすることができませんでした。
次に、High Resolution Melting Analysis（HRMA）を使用して、エクソン全体をシーケンスすることなく変異を同定しました。しかし、いくつかの遺伝子のみに焦点を絞ることができたため、そのアプローチは十分に包括的ではなかったでしょう。
ゲノムワイドなヒトSNPアレイを使用して、コピー数の変動を調べ始めました。この手法により、1回のラウンドで何百人もの患者を処理して、現在フォローアップしているループスに関連するコピー数の変化を特定できました。しかし、これらのテクノロジーのいずれも、希少変異について多数の遺伝子を調べることはできません。
"エクソームシーケンスにより、被験者の希少な新規遺伝子バリアントを同定し、疾患を引き起こす能力を検査することができます。"
Q：ループスの研究にNGSをどのように使用していますか？
CV：2010年にHiSeq 2500システムを使用して全エクソームシーケンス（WES）を開始しました。WESにより、被験者の希少な新規遺伝子バリアントを同定し、疾患を引き起こす能力を検証することができます。
APOSLEコホートの被験者のエクソームとゲノムのシーケンスを行っています。我々は、強い効果を発揮する1つまたは少数の希少な遺伝子バリアントによって引き起こされる症例を充実させるために、同時性症例、マルチプレックスファミリー、および早期疾患発症の患者を含む、極端または重度の表現型に焦点を当てています。まれなバリアントが説明できる症例はわずかですが、疾患の病因を理解するのに非常に有益な場合があります。
マルチプレックスファミリーのトリオまたは複数の影響を受けた被験者のゲノムをシーケンスします。当社は、自社で開発したバイオインフォマティクスパイプラインと優先順位付けアルゴリズムを通じてシーケンスを実行し、疾患を引き起こす可能性のある候補遺伝子のリストを絞り込みます。次に、CRISPR-Cas9を使用して1つまたはいくつかの推定疾患原因変異をマウスに導入し、これらのマウスが自己免疫を発症するかどうかを調べます。すべてのヒト症候群がマウスで再現できるわけではなく、一部の分子はマウスとヒトで異なるシグナルを示します。しかし、ヒト被験者からの変異がマウスに導入され、マウスがループス様の徴候を発症し始めると、被験者が担う変異が疾患の一因であると結論付けることができます。
Q：HiSeq 2500システムは貴施設でどのように機能しましたか？
CV：私のバイオインフォマティクスの同僚であるMatt Fieldは、当社のシーケンスパイプラインをコード化し、HiSeq 2500システムの最も優れた機能の1つは柔軟性であると信じています。カバレッジに優先順位を付けるとシーケンスコンテンツを最大化し、スピードに優先順位を付けるとランタイムを最小化できるカスタムランモードを提供します。また、ベースペアあたりのコストも低く抑えられます。HiSeq 2500システムは、その柔軟性、迅速なターンアラウンドタイム、ハイスループット機能により、ヒト疾患におけるバリアント発見に最適なプラットフォームです。当社はHiSeq 2500システムのエクソームデータを日常的に使用しており、常にシーケンスの品質に感銘を受けています。
"HiSeq 2500システムは、その柔軟性、迅速なターンアラウンドタイム、ハイスループット機能により、ヒト疾患におけるバリアント発見に最適なプラットフォームです。"
Q：あなたの研究における全ゲノムシーケンス（WGS）の価値は何ですか？
CV：カバレッジが十分でなかったため、ときにWESの変異を見逃すことがわかりました。WGSはエクソン領域でもより深く、より均一なカバレッジを提供し、偽陰性を減らすため、実施することにしました。これは、キャプチャーキットの違いによるものです。
Q：WGSにHiSeq X Tenシステムを採用した理由は何ですか？
CV：WGSにHiSeq X Tenシステムを使用することは、HiSeq 2500システムよりも費用対効果が高く、高速です。通常、WGS用に20～50のサンプルのバッチを送付します。所要時間は3～6週間です。
ラボにHiSeq X Tenシステムはありません。上海のレンジ病院にChina-Australia Centre for Personalized Immunology（CACPI）を設立したため、私たちはWGSサンプルをMacrogeneに送り、最近ではNovogeneに送りました。オーストラリアを拠点とするコホートについては、近い将来、ガーバン研究所にWGSサンプルを送付し始めるかもしれません。
"WGSにHiSeq X Tenシステムを使用することは、HiSeq 2500システムよりも費用対効果が高く、高速です。"
Q：バリアントをどのように解析しますか？
CV：弊社独自のバリアントデータベースを開発しました。このデータベースには現在、ループスやその他の自己免疫不全疾患を持つCPI患者を含む300人の被験者から800万以上のバリアントが含まれています。頻度、損傷の予測、被験者コホート、遺伝モードなど、さまざまな基準に基づいてバリアントをスキャンし、引き出します。被験者の臨床情報を含めることで、このデータベースのパワーを高めることを目指しています。
Q：バリアントデータベースの>800万のバリアントのうち、どのバリアントを研究すべきかを優先しますか？
CV：弊社独自の優先順位付けツールを使用して、どのバリアントを研究するかを同定します。疾患に特異的なため、免疫障害の種類によって異なる基準があります。特に希少で有害なバリアントを探しています。当社のパイプラインは、dbSNPおよびExome Aggregation Consortium（ExAC）データセットからの周波数を提供します。3つの機能アノテーションツール（PolyPhen、SIFT、およびCADD*）を使用して損傷をスコアリングします。また、臨床的意義が割り当てられたバリアント、およびゲノムワイド関連解析（GWAS）データを含むいくつかの異なる基準やソースに従って、免疫機能や疾患に対する遺伝子の関連性も考慮します。これらすべての要因を考慮し、バリアントをランク付けするアルゴリズムを開発しました。当社のシステムは完璧ではありませんが、臨床的に重要になる可能性があると考えられるバリアントをいくつか特定しています。
Q：ループスと自己免疫疾患の研究における次のステップは何ですか？
CV：ループスに関しては、2つ以上の希少なバリアントが疾患の発症に関与していると思われるケースがいくつかありました。遺伝の転移の可能性を調べるために、堅牢なツールを使いたいと考えています。これらのバリアントの機能的重要性を単独および組み合わせで調査できるように、1つまたは複数の変異を持つマウスモデルを生成しています。私たちが被験者で同定する変異がタンパク質や細胞機能にどのような変化をもたらすかを理解することは、疾患の病因を理解するために不可欠です。最終的には、より正確な診断を行い、より効果的でターゲットを絞った治療法を開発できるようになります。
他の免疫疾患の研究にも同様のアプローチを採用しています。自己免疫疾患については、一部の複雑な疾患と同様に、さまざまなバリアントが見つかると考えています。すなわち、作用の弱い一般的なバリアントの混合から、その疾患を引き起こす強力な作用を持つ少数または単一の希少なバリアントまでです。
"ループスの分子診断により、よりターゲットを絞った治療を患者に提供できるようになります。"
Q：自己免疫疾患の分子診断は何を可能にしますか？
CV：現在、ループスの幅広い診断があります。しかし、これは1つの疾患ではなく、むしろ、臨床で同じように現れ、異なる遺伝子やパスウェイによって引き起こされるいくつかの異なる疾患であると考えています。特定の分子経路の欠陥に従って患者をサブ診断またはサブグループに層別化できれば、有益となりうるさまざまな治療オプションを特定できる可能性があります。
現時点では、ループスに対する特定の治療法はありません。私たちは、病気をコントロールするためにステロイドなどの幅広い免疫抑制剤を使用する傾向があります。しかし、多くのモノクローナル抗体を含む、潜在的に使用できる免疫調節薬が数多く存在します。しかし、一部の患者がレスポンダーであるのに対し、レスポンダーでないのはなぜかという遺伝学は理解できません。将来的には、ループスや薬物レスポンダーの分子基盤を理解できれば、より的を絞った治療を提供できるようになります。
例えば、脳性ループスを持つ少女にTREX1の稀なホモ接合性変異が認められ、1型インターフェロン応答が過剰になります。6 1型インターフェロン遮断薬が市販されていますが、すべてのループス症例にこのような特徴があるわけではありません。分子的原因の同定は、特定の症例のサブセットで有用となりうる治療法を示唆している可能性がありますが、その他の治療法では有用ではありません。
Q：個別化医療を実現するためには何が必要だと思いますか？
CV：一部の疾患では、どのような治療が最も効果的かを知るために分子診断が必要になることが明白になりつつあります。複雑な疾患では、特定の変異や特定の診断につながる一連の変異のように単純なものかどうかについて疑問視されています。
医学部でゲノミクスの臨床的有用性を教えることは、個別化医療をより一般的にする上で役立つと思います。ゲノミクス医学が医療トレーニングや臨床診療にほとんど浸透していないことは驚くべきことです。現在、当センターでは臨床医向けの個別化免疫学の年次クラスと、当社のパイプラインを通り抜けたヒトゲノムの推定疾患原因遺伝子バリアントを発見するためのオンラインツールの使い方に関する大学院生向けの2日間の学校が運営されています。ゲノミクス医学が医学カリキュラムに統合されるまでには時間がかかりません。
最後に、シーケンスのコストが下がると、診療に大きな違いが生じ、これらの診断手順がより一般的になる可能性があります。
Q：研究におけるジェンダー平等の問題に情熱を注いでいます。この取り組みにどのように関与していますか？
CV：子供が生まれるまでは、科学の女性であることに問題があったとは感じませんでした。誰にでも科学研究ができると思った。最初の妊娠期間中、Istrugledは自分自身と私の研究を支援する助成金申請を書く時間を見つけましたが、非常にストレスがかかりました。同僚やポスドクも同じ厳しい時期を経ています。突然、数年にわたる論文のギャップがあり、それだけで次の助成金やフェローシップを得られなくなります。最終的には、多くの女性がシステムを完全に離れなければなりません。
当社は、チャンスに値する多くの優秀な女性サイエンティストに多大な投資を行っています。妊娠中や育児初期に科学が鈍化した時に、この超競争的なシステムから簡単に排除できることは本当に残念なことです。私は現在、National Health and Medical Research Council（NHMRC）のWomen in Scienceワーキンググループの一員です。このグループは、女性科学者に多大な影響を与え、資金を増やす可能性のあるイニシアチブを研究しています。7
承認されている有望な新しいステップがいくつかありますが、現時点では開示できません。これは、資金を申請する女性に大きな違いをもたらすことが期待されます。これらのステップは2016年後半に発表されます。オーストラリアの女性向けの助成金やフェローシップパネルを強く支持してきました。また、John Curtin School of Medical Researchでジェンダーエクイティ委員会を立ち上げました。8 出産休暇から復帰した女性のための初のフルファンディングフェローシップをすでに確立しています。また、出産休暇を取る女性サイエンティストのジェンダーエクイティ賞も開始し、育児や生産性向上に役立つその他のニーズに資金を提供しました。
この記事で言及されているイルミナシステムの詳細はこちら：
HiSeq Xシリーズ、www.illumina.com/systems/hiseq-x-sequencing-system.html
HiSeq 2500システム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/hiseq-2500.html
参考文献
3. Yu D, Rao S, Tsai LM, et al. 転写リプレッサーBcl-6は、T濾胞ヘルパー細胞系統のコミットメントを指示します。イミュニティ 。2009; 31(3): 457～468。
4. Linterman MA, Rigby RJ, Wong RK, et al. 全身性の自己免疫には、濾胞ヘルパーT細胞が必要です。J Exp Med . 2009; 206(3): 561～576。
5. Linterman MA, Pierson W, Lee SK, et al. Foxp3+濾胞制御性T細胞は胚中心応答を制御します。Nat Med. 2011; 17(8): 975～982。
7. オーストラリア政府、国家保健医学研究評議会。健康科学の女性 www.nhmrc.gov.au/research/women-health-science. 2016年6月25日にアクセス。
*PolyPhen：アミノ酸置換がヒトタンパク質の構造と機能に与える可能性のある影響を予測します。
SIFT：アミノ酸置換がタンパク質機能に影響を与えるかどうかを予測します。
CADD：ヒトゲノムにおける一塩基バリアントおよび挿入/欠失の有害性をスコアリングします