神経多様性のマッピング：マウス初代視覚皮質における神経同一性の分子解析

はじめに

アメリカの未来学者、物理学者、著者である学久道夫は、ヒトの脳には1,000億のニューロンがあり、各ニューロンは他の10,000のニューロンとつながっています。肩に座ることは、既知の宇宙の中で最も複雑な物体です。彼の言葉は誇張ではありません。実際、今のところ、サイエンティストは、マウスのように比較的単純な哺乳類の脳に、ヒトの脳だけでなく、いくつの異なる種類のニューロンが見られるかさえ教えてくれません。

Allen Institute for Brain Scienceは、脳の内的働きを理解するために活動する独立した非営利研究機関であり、その変化を図っています。Allen InstituteのCell Typesプログラムの研究者であるBosiljka Tasic博士は、マウス視覚システム内のニューロンの同一性を定義するため、分子解析法のパイオニア的開発、トランスクリプトームの解析、および個々のニューロンのエピジェネティックランドスケープの開発を行っています。Allen Instituteの使命と、イルミナのシーケンスシステムを用いたシングルセルシーケンスがどのようにニューロンの分類の取り組みを変革しているかについて、iCommunityと話しました。

Q：Allen Institute for Brain Scienceの使命は何ですか？

Bosiljka Tasic（BT）：Allen Instituteの使命は、人間の脳がどのように働くかの理解を加速することです。この野心的なミッションにインパクトを与えるため、マウスの脳を構成する多種多様な細胞内で、どのように情報がコード化され、処理されるかを研究しています。マウスは最もアクセスしやすい哺乳類モデルシステムであり、情報処理の原理の多くは哺乳類の間で保存されています。マウスの視覚系を研究し、霊長類や人間と比較することで、人間の独自性を理解するために、基本的な情報処理フレームワークを定義する計画です。

これを達成するために、標準的な学術研究室とは異なる組織構造と規模があります。私たちは、さまざまな専門知識を持つ多くの科学者を集結させ、真に学際的な方法で重複するチームにまとめています。また、これらの研究の主要データを、百科事典リソースとして当社のウェブサイトでコミュニティに提供します。当社の最新のリソースの1つは、この脳領域を構成する個々のニューロンの遺伝子発現データ、生理学、形態など、マウスの一次視覚皮質（V1またはVISpとして知られる）の細胞型に焦点を当てています。

Q：V1を構成する細胞の種類は何ですか？

BT：V1は、視覚情報を処理する皮質の主領域です。この皮質領域内の細胞多様性の程度については、ほとんど理解していませんでした。主な種類は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロン、非ニューロン細胞、そしてこれらの主要カテゴリーのそれぞれに含まれるさらなる細分化です。皮質は多くの人々によって研究されていますが、細胞多様性の包括的な説明と、単一細胞レベルでの異なる種類の情報の相関性は存在しませんでした。ほとんどの研究は、通常、複数のパラメーターに基づいており、多次元データセットに基づいていません。たとえば、3つの遺伝子を使用して細胞を分類すると、1つの画像が得られることがあります。しかし、すべての遺伝子を見ると、全く異なる見解が得られるかもしれません。

“シングルセルmRNAシーケンスを使用して、細胞あたり数千の遺伝子を検出し、すべての細胞について高度な多次元データセットを取得できます。”

Q：シングルセルトランスクリプトームシーケンスがこれらの研究にとって貴重なツールであるのはなぜですか？

BT： シングルセルトランスクリプトームシーケンスが有利な理由はいくつかあります。これはゲノムワイドな手法で、細胞に発現するすべての遺伝子を最適な近似値で解析します。多くの遺伝子に基づく細胞の多様性を捉えることができます。シングルセルmRNAシーケンスを使用して、細胞あたり数千の遺伝子を検出し、すべての細胞について高度な多次元データセットを取得できます。その前に、人間は最大でいくつかの遺伝子に基づいて細胞を特徴づけます。重要な遺伝子を調べたのであれば、それで十分かもしれません。しかし、重要な遺伝子が何であるかはわかりませんでした。

Q：シングルセルmRNA-Seqを用いたV1ニューロン細胞について、どのようなことを発見しましたか？

BT：シングルセルmRNA-Seq研究の開始時期はわかりませんでした。品質管理基準に合格し、シーケンス情報が良好なトランスジェニックマウスのV1から約1700個の細胞を収集しました。V1皮質領域では49の型を定義することができ、42の型がニューロン、7の型が非ニューロンでした。¹ 42のニューロン型のうち、約半分がGABA作動性ニューロン、残りの半分がグルタミン作動性ニューロンであることがわかりました。

この細胞分類解析の長所は、偏りがないことです。このシングルセルデータセットをクラスター化して分解した際、V1のどこから細胞が来たか（どの細胞層とどのトランスジェニックライン）を知らなかったのです。2つの並列クラスター化アプローチと、次に3番目の検証レイヤーの解析を行い、発見した遺伝子発現シグネチャーを考慮して、各単一細胞をタイプにどの程度堅牢に分類できるかを判定しました。既知のマーカー遺伝子または新しいマーカー遺伝子に基づいて、興奮性、抑制性、または非ニューロン性のアイデンティティタイプを事後的に割り当てました。

Q：ファジーと特徴付けたクラスターがいくつか見つかりました。それは何を意味し、どのような意味合いを持つのでしょうか？

BT：バイオインフォマティクスの専門家と仕事をする際、細胞タイプについて取得した遺伝子発現シグネチャを調べ、すべての細胞についてこれらのタイプにどの程度一致しているかを尋ねたいと考えました。反復的な機械学習アプローチを使用するこの検査では、特定の細胞が一つのクラスターに、また別のクラスターに分類することがあることが明らかになりました。これらの中間細胞と呼ばれる細胞は、研究論文では通常見られない見解を私たちに提供します。これらは、不明瞭な同一性を持つ細胞であり、特定の細胞タイプに多く見られます。一部のクラスターは、多くの中間細胞によって接続されています。他のクラスターは、この多次元遺伝子発現空間で1つの位置を占めており、それらと他のクラスターの間に中間細胞はありません。

これらのデータから、すべての細胞型が厳密に分離した同一性を持つわけではないことが示唆されます。一部の細胞タイプは明確に分離できない可能性があり、実際には表現型の連続性の一部である可能性があります。これは、ニューロンが活動や経験に応じて変化し、動物の生涯にわたる行動を変えるのに必要な可塑性を持つことがわかっている、ニューロン科学の外国概念ではありません。

NGSでは、これまでに発見されなかった新しいマーカーを多数同定し、その発現をその後別の方法で確認しました。

Q：トランスクリプトームを解析するために、これまでにどのような手法を用いましたか？

BT：次世代シーケンサー（NGS）と並行してqRT-PCRを実施しました。しかし、qRT-PCRの問題は、どの遺伝子を調べたいかが必ずしも分からないことです。ゲノムワイドではない方法の問題は、遺伝子の選択に膨大な時間を費やしても正しい答えが得られないということです。以前のゲノムワイドな知識に基づいて遺伝子選択を行わないと、選択にバイアスがかかり、完全なトランスクリプトームランドスケープをうまく表現できなくなります。

mRNA-Seqは、ゲノムワイドな遺伝子発現プロファイルを提供し、トランスクリプトームランドスケープにおける部門を最もよく示す遺伝子を特異的に選択することができます。遺伝子の一部は以前から知られていましたが、NGSで同定される前には知らなかった個々のニューロンタイプの最良のマーカーとして現在使用されている遺伝子も多くあります。その代わりに、文献にある遺伝子を使用しましたが、すべてのメソッドに独自の感度の問題があるため、多くの遺伝子は検査または検出されませんでした。NGSでは、これまでに発見されなかった多くの新しいマーカーを同定し、その後別の方法で発現を確認しました。

Q：どのように細胞分離を行いましたか？

BT：細胞分離は大きなハードルでした。成人の神経系組織は懸濁液に解離しにくいため、成人の生きたニューロンの単離は困難です。細胞は高度に相互接続されており、細胞分離プロセスでは、軸索と樹状突起が裂けて、多くの細胞が生存しません。さらに、一部の希少細胞タイプにアクセスするには、多くの細胞をプロファイリングする必要があります。そこで、特定の細胞群が蛍光タンパク質で標識される細胞ソースとしてトランスジェニックCreラインを使用することにしました。次に、成体脳の細胞懸濁液を作製するための手順を最適化し、シングルセル単離のための蛍光活性化セルソーティング（FACS）を確立しました。このようにして、希少な細胞集団を分離することができました。これは、偏りのない方法で、希少な細胞をより多くの頻度でサンプリングできるからです。したがって、当社の細胞サンプリングは偏りなく行われませんでしたが、希少な細胞型を標識できるトランスジェニック系統から意図的に選択し、単離しました。このアプローチを用いて、非常に信頼性の高いシングルセル分離を得ました。

BT：MiSeqシステムを用いて比較的浅いシーケンスにより、ラボでライブラリーバリデーションシーケンスを実施しました。その後、HiSeqシステムを持つ複数の現地のコアラボに、より深いライブラリーシーケンスを委託しました。

MiSeqシステムを社内に導入することで、メソッドの開発と変更を迅速に行い、HiSeqシステム上でより深いシーケンスを行うためにコアラボに送出する前に、優れたライブラリーがあることを確認できました。

Q：MiSeqシステムを選んだ理由は何ですか？

BT：特にプロセスの開発中に、ライブラリー検証を実行するために、社内で高速ターンオーバーシステムが必要でした。MiSeqシステムを社内に導入することで、メソッドを迅速に開発して変更し、HiSeqシステム上でより深いシーケンスを行うためにコアラボに送る前に、優れたライブラリーがあることを確認できました。それは私たちにとって良い組み合わせでした。

Q：どのようなライブラリー調製キットを使用していますか？

BT：いくつかのアプローチをテストし、単一細胞からのサンプルを確実に増幅できるClontechのSMARTerを選択しました。V1試験では、SMARTer Version 1を使用しました。SMART-Seq 4は現在利用可能で、新しい研究に使用されています。SMARTerで得られたcDNAからのライブラリー調製には、Nextera XT Library Prep Kitを使用しました。これにより、NGSライブラリー調製とバイパスソニケーションに少量のcDNAを使用できるようになりました。

単一細胞トランスクリプトーム解析が行われるまで、不均一な組織を採取し、その中の分子型を偏りなく定義する方法はありませんでした。

Q：シーケンスランのパラメーターは何でしたか？

BT：新しい細胞型を区別するために適切な解像度を得るために必要な深度がわからなかったため、最初はシーケンス深度にオーバーボードしました。早期のシングルセルサンプルから約2,000万～3,000万リードまでcDNAのシーケンスを行い、時にはさらに高いレベルにしました。その後、in silicoでリードサブサンプリングとクラスター化を行い、ほとんどの細胞について、細胞あたり500万～1,000万のトータルリードを得ることで十分であると判断しました。

ニューロンと非ニューロンを区別したい場合や、興奮性細胞と抑制性細胞を区別したい場合、このような深度は必要ありません。これらの研究では、はるかに低い深度を使用できます。セルあたり10万リード以下であれば十分です。しかし、関連するニューロンのサブタイプを区別したい場合、得られた細胞数でより深いシーケンスが必要でした。

Q：シングルセルシーケンスでは、他のアプローチでは見えなかったのはどのような情報ですか？

BT：シングルセルシーケンスは、皮質だけでなく、細胞タイプの分類にも寄与しています。シングルセルトランスクリプトーム解析を行うまで、不均一な組織を採取し、その中の分子型を偏りなく定義する方法はありませんでした。シングルセルトランスクリプトミクスでは、最初にどの遺伝子を使用すべきかを尋ねることなく、組織をタイプに分解することができます。代わりに、すべての遺伝子を調べることができます。

シングルセルシーケンスの前は、異なる細胞タイプの合理的に包括的なインデックスを構成するものは何かも知らなかった。何千ものタイプについて話していましたか？ 大きさの順序はどのくらいですか？ 私たちの研究では、50種類のV1細胞について話しており、その中にはあいまいなものもあるかもしれません。私たちの仕事が本当に包括的であるとは言えません。また、同定できなかった希少な細胞の種類があるかもしれません。そのため、最終的にこの脳領域内にはさらに数十の領域が存在する可能性があります。

最後に、シングルセルシーケンスにより、特定の細胞タイプに特異的なマーカーを定義できるようになりました。これは、これらの特定のタイプにアクセスできるツールの構築に非常に大きな影響を及ぼします。今ではレシピがあります。例：遺伝子Aと遺伝子Bの組み合わせは、細胞タイプZへの特定のアクセスを提供します。推測する前は、これらの新しいツールにより、異なる細胞タイプの機能を定義し、神経回路内でどのように機能するかを調べることができます。

異なる皮質領域からのシングルセルmRNA-Seqデータを比較することで、細胞タイプの保存と独自性に関する新しい質問をすることができます。

Q：研究の次のステップは？

BT：私たちの研究は、ある意味パイロット研究でした。明確に定義された解剖学的領域で成人皮質細胞を用いてシングルセルmRNA-Seqを実施できることが示されました。ここで、他の明確に定義された領域、特に他の皮質領域について、プロファイリングを行いたいと思います。異なる皮質領域からの単一細胞mRNA-Seqデータを比較することで、細胞タイプの保存と独自性に関する新しい質問をすることができます。

外部の学術研究室との協力関係がいくつかあり、彼らのお気に入りの脳領域の細胞を分類するアプローチを採用しています。この手法を使用すると、V1とは大幅に異なる機能的役割を持つ可能性のある脳の領域を分解することができます。特定の遺伝子ツールを構築することで、研究したい特定の行動における特定の細胞型の機能について尋ねることができます。とてもワクワクしています。

MiSeqシステム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html

HiSeqシステム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/hiseq-2500.html

Nextera XT DNA Library Prep Kit、www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html

参考文献