次世代シーケンサー(NGS)とqPCRテクノロジーを比較する際、主な違いは発見力です。どちらも高感度で信頼性の高いバリアント検出を提供しますが、qPCRは既知のシーケンスのみを検出できます。対照的に、NGSは、シーケンス情報の事前知識を必要としない仮説のないアプローチです。NGSは、新規遺伝子を検出するためのより高い発見力と、希少バリアントや転写産物を定量化するためのより高い感度を提供します。
NGSテクノロジーとqPCRテクノロジーも、スケーラビリティとスループットが異なります。qPCRはターゲット数が少ないと効果的ですが、複数のターゲットではワークフローが煩雑になることがあります。ターゲットやサンプルの多い研究にはNGSが推奨されます。1回のNGS実験で、数千のターゲット領域にわたるバリアントを単一塩基分解能で同定できます。
バリアントの同定において、ヒットアンドミス遺伝子関連研究がどのように行われているかが明らかになりました。漁業の遠征のようなものでした。NGSによってゲノムのはるかに大きな部分を同時に見ることができることに気づきました。
qRT-PCRは少数の遺伝子の発現を定量化するのに有用ですが、既知のシーケンスしか検出できません。対照的に、NGSを用いたRNAシーケンス(RNA-Seq)では、既知の転写産物と新規の転写産物の両方を検出できます。RNA-Seqは事前に設計されたプローブを必要としないため、データセットに偏りがなく、仮説のない実験デザインが可能になります。
遺伝子発現プロファイリングなどのリードカウント法では、NGSのデジタル特性により、実質的に無制限のダイナミックレンジが可能です。RNA-Seqは、リファレンスシーケンスにアライメントされた個々のシーケンスリードを定量化し、相対発現値ではなく絶対発現値を生成します。この幅広いダイナミックレンジにより、発現の微妙な変化を10%まで検出できます。RNA-Seqは、遺伝子発現の定量化以外にも、新規転写物、あるいはスプライシングされたアイソフォーム、スプライス部位、および低分子RNAとノンコーディングRNAを同定することができます。1,2
アプリケーションノートを読むNGSとqPCRのどちらを選択するかは、サンプル数、ターゲット領域のシーケンス合計量、予算上の考慮事項、研究目標など、いくつかの要因によって異なります。ターゲット領域数が少ない場合(≤ 20ターゲット)や研究の目的が既知のバリアントのスクリーニングまたは同定に限定されている場合、qPCRは通常良い選択です。そうでなければ、NGSはニーズに合っている可能性が高くなります。ターゲットNGSメソッドは、複数のサンプルにわたって複数の遺伝子を同時にシーケンスできるので、従来の反復法に比べて時間とリソースを節約できます。また、NGSはより高い検出力を提供し、新規バリアントの検出を可能にします。
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