HIV-1指向性研究のための新技術への移行

はじめに

Jacques Izopet博士とStephanie Raymond博士は、フランスのトゥールーズにあるUniversité Paul Sabatierで、HIV指向性（サイドバー）と感染進行中にどのように変化するかを調べました。過去10年間にわたり、彼らはさまざまな表現型と遺伝子型の手法を使用して、コア受容体を使用してHIVがどのように細胞に入るかを評価してきました。2010年、HIV 1型（HIV-1）コア受容体の使用状況を評価するために、Roche 454システム上で次世代シーケンサー（NGS）法を開発しました。その後、Rocheは454システムが製造中止となり、試薬がすぐに使用できなくなると発表しました。

チームは新しいNGSプラットフォームの特定に取り組みました。彼らはMiSeqシステムを選択し、深いシーケンス感度、コア受容体評価データ、および全体的な性能に焦点を当てて比較研究を開始しました。¹

iCommunityは、Izopet博士とRaymond博士と話し合い、MiSeqシステム上でHIV-1指向性検出法をどのように評価したか、そして得られた結果について学びました。

Jacques Izopet博士は、Virology Laboratoryのディレクターであり、Stephanie Raymond博士は、フランスのトゥールーズにあるUniversité Paul SabatierのVirology部門の研究者です。

Q：HIV-1指向性はどのように決定されますか？

StéphanieRaymond（SR）：HIV-1コア受容体使用の主な遺伝子型決定因子は、gp120エンベロープ糖タンパク質の第3可変ループ（V3）のシーケンスに基づいています。V3アミノ酸のシーケンスからHIV-1コア受容体の使用を予測するアルゴリズムを開発しました。

Jacques Izopet（JI）：また、ウイルスの細胞への侵入メカニズムを決定するために、Tourouse Tropism Test（TTT）という表現型アプローチも開発しました。TTTは、血漿サンプルから単離されたRNAを使用してgp120 env遺伝子をコードする断片を増幅するために、逆転写PCR（RT-PCR）を使用します。この製品は、チャレンジされたenv遺伝子を発現する組換えウイルス粒子を生成するために使用されます。次に、これらの粒子が上清に放出され、CD4を保有し、CCR5またはCXCR4（サイドバー）のいずれかを発現するU87インジケーター細胞に感染します。

Q：ジェノタイプHIV-1指向性研究は、TTT表現型エントリーアッセイと比較してどうですか？

SR：TTTなどの組換えウイルス表現型アッセイは、HIV-1指向性を決定するゴールドスタンダードと考えられていますが、そのルーチンの使用は、高いコストと長いターンアラウンドタイムによって妨げられています。対照的に、NGSジェノタイピングHIV-1指向性検査は簡単で迅速、安価です。しかし、ジェノタイピング検査は、HIVのnonBサブタイプの指向性を決定する上で性能が劣ることが多いです。

JI：V3 env領域の超ディープシーケンスにより、表現型アプローチのように低レベルのCXCR4バリアントを検出できます。

Q：Roche 454システムでHIV-1指向性解析法をどのように検証しましたか？

JI：2010年には、Roche 454 GS-Junior Systemを使用してHIV-1 V3 env領域のシーケンスを行いました。システムを検証するため、TTT表現型細胞検査に大きく依存しました。得られた一致性は良好で、解釈アルゴリズムを確立できました。これらのアルゴリズムは、HIV-1指向性NGSデータの解釈用に設計されたPyroVirソフトウェアの基盤となりました。

"MiSeqシステムのシーケンス速度により、より多くのサンプルを処理できます。"

Q：HIV-1指向性解析のために他のNGSシステムを検討するきっかけとなったのは何ですか？

JI：Roche 454テクノロジーのライフサイクルの終了が発表されると、他のNGSテクノロジーの検査の重要性が認識されました。Roche 454試薬が利用できなくなるというニュースは避けられませんでした。MiSeqシステムに注目しました。

Q：比較研究をどのように行いましたか？

SR：抗レトロウイルス薬未治療の被験者の52の血漿サンプルを用いて、MiSeqプラットフォームとRoche 454プラットフォームのディープシーケンスデータを比較しました。アルゴリズムを用いて各システムからのNGSデータを解釈し、HIV-1コア受容体の使用を決定しました。TTTをリファレンスアッセイとして使用しました。また、X4ウイルスを検出するための感度パラメーターと、20のウイルスクローンを使用してこれらのバリアントを定量化するための線形パラメーターも検証しました。

Q：比較試験の結果はどうでしたか？

SR：MiSeqシステムは、X4の小さな変異を検出する感度が高く、HIV-1指向性を決定するTTTゴールドスタンダードとよく相関しています。軽微なCXCR4-usingバリアントを検出するためのMiSeqシステムとRoche 454システムの感度は類似しており、MiSeqシステム5,000リードに対して0.26%、Roche 454システムでは2,000リードに対して0.25%でした。

軽微なX4バリアントの定量化に対する感度を決定する際、MiSeqシステムRoche 454システム（1～5%）よりも感度が高く（0.5～1%）、これはおそらくMiSeqシステムより多くのリードが得られたためです。

2つのNGSアッセイは、52の臨床サンプルのうち90%の解析で一致しており、HIV-1指向性を予測する2つの表現型アッセイの一致に類似していました。両方のNGSアッセイとTTTの一致率は70%を超えました。

MiSeqシステムは、X4の小さな変異を検出する感度が高く、HIV-1指向性を決定するTTTゴールドスタンダードとよく相関しています。 ”

Q：HIV-1エンベロープ全体のシーケンスはHIV-1指向性予測を改善できるか？

SR：現在V3 env領域で同定されている指向性の決定因子は、最適な予測を得るには十分ではないといういくつかの健全な議論があります。ウイルスエンベロープの他の領域は、ウイルス侵入のためのコア受容体の使用に関与していると考えています。

JI：ジェノタイプアッセイとは対照的に、TTTアッセイでは完全なエンベロープシーケンスを使用します。HIV-1エンベロープ全体のシーケンスを可能にする新世代のシーケンスシステムと、他の領域の解析に基づく新しいアルゴリズムにより、HIV-1コア受容体使用の遺伝子型予測が改善されます。

目標は、さまざまなサブタイプを含む感度を高めることです。サブタイプBは、南北アメリカ、西ヨーロッパ、オーストラリアにおける主要なサブタイプです。サブタイプBのHIV-1エンベロープ全体のシーケンスは、X4ウイルスを同定するための参照検査よりも感度が高くなります。また、非Bサブタイプの指向性をより信頼性の高い方法で決定します。

Q：特定のウイルスサブタイプに対する検証済みの遺伝子型アルゴリズムの価値は何ですか？

SR：ウイルスサブタイプに適応した予測アルゴリズムを持つことが不可欠です。NGSから得られた生データは、ウイルス指向性を予測するために解析する必要があります。ここ数年、ウイルスサブタイプ間のトロピシムの違いを説明する予測アルゴリズムの開発を目指してきました。最も頻度の高いHIVサブタイプについては、特定のアルゴリズムがすでに開発されていますが、すべてのHIVサブタイプについてアルゴリズムを作成することが重要です。

Q：MiSeqシステムワークフローは、Roche 454のワークフローと比較してどうでしたか？

SR：MiSeqシステムサンプル調製ステップは、Roche 454ランの調製ステップよりも簡単です。また、操作が少ないため、MiSeqシステムの実行間のばらつきも少なくなっています。Roche 454システムは、より経験豊富な技術者を必要とします。ビーズの分布品質と試薬の感度に問題があります。

"MiSeqシステムは、性能とコストの面で当社に最適です。"

Q：ウイルス学研究におけるMiSeqシステムの利点は何ですか？

JI：MiSeqシステムのシーケンス速度により、より多くのサンプルを処理できます。コアラボでは、必要なリード数を得るために、ランあたりのサンプル数を最適化する必要があります。シリーズごとのサンプル数と解析深度を決定するのは各ユーザー次第です。MiSeqフローセルはこの柔軟性を提供し、ラボで適応させることができます。MiSeqシステムは、性能とコストの面で当社に最適です。

Q：研究の次のステップは何ですか？

JI：次のステップは、MiSeqシステム、特にCXCR4を使用するウイルス集団を使用して、ウイルス集団の正確な定量化を得ることです。最適化が最小限に抑えられているため、すでに良好な一致性が得られています。すぐに満足のいく結果が得られると確信しています。