GBSがヤギ群れの選択的な育種を実現

はじめに

マイクロアレイベースのジェノタイピングにより、群れの管理者や農家は特定の種の特定の遺伝的形質を育てることができます。近年、乳牛や牛、羊、トウモロコシ、小麦、ソロガムなど、世界的に普及している主要な種で利用され、その利用は急速に拡大しています。しかし、小規模の家畜や孤児の作物種におけるゲノミクスベースの育種と選抜プログラムをサポートするマイクロアレイツールの開発と実装には、依然として大きなコスト、ノウハウ、リソースの障壁が存在します。これらのアプリケーションのソリューションは、シーケンスによるジェノタイピング（GBS）かもしれません。

ニュージーランドを拠点とする研究機関であるAgResearchは、最近、オーストラリアのヤギの農家/チーズ生産者であるMeredith Dairyが、群れのためのゲノミクスベースの選択プログラムを構築する任務を任されました。ヤギは些細な家畜種です。家畜の規模は一般的に小さく、農業に関連する予算も小さくなります。Meredith Dairy、Sandy、Julie Cameronの所有者には、約9,000頭のヤギで構成される群れに関する遺伝情報がありませんでした。プリンシパルサイエンティストのJohn McEwanとAgResearchチームは、GBSを使用して、メレディス乳牛群れのゲノム選択プログラムを実施しました。AgResearchは、6カ月未満で、Cameronに群れの予測性の高いゲノム予測育種値（GEBV）を提供しました。

iCommunityはJohn McEwanと話をし、GBSが小家畜や孤児の作物のゲノム情報を求める人々にどのように役立つか、なぜ従来のアレイよりも費用対効果が高いのか、そして世界中の育種プログラムの改善におけるこのテクノロジーの将来について学びました。

John McEwanは、ニュージーランドのAgResearchの主任サイエンティストです。

Q：AgResearchとは何ですか？また、どのような研究を行っていますか？

John McEwan（JM）：AgResearchは、クラウン研究所としてニュージーランド政府が運営する民間企業です。研究機関ですが、企業でもあり、政府機関であった場合よりも商業的な存在になることができます。当社のグループにはGenomNZ*という商号があり、

多種多様な種があります 私たちのラボでは、半数の人がアグリゲノミクス研究を行っています。そのほとんどは、政府または業界によって資金提供されているか、部分的に資金提供されています。

Q：AgResearchのアグリゲノミクス研究は、過去30年間でどのように変化しましたか？

JM：AgResearchのゲノミクス研究は1985年に始まり、長年にわたって大きく変化してきました。最初の5年間は、DNAとタンパク質の2つの研究が焦点でした。タンパク質研究は、シカの品種組成を推定するために商業的に用いられました。DNA研究では、最初にサザンブロットなどの手法を使用しました。1990年には、マイクロサテライトと定量的形質遺伝子座（QTL）マッピング、DNAミックスとマッチの親子に移行しました。1990年代後半、より多くのSNP**ジェノタイピングを実施しました。しかし、リファレンスゲノムを持つ動物を研究していなかったため、各マーカーを開発する必要がありました。

2000年代初頭、私はウシゲノムのシーケンスと開発に関与し、ヒツジゲノムの完成を推し進めました。また、SNPの発見も行いました。約10年前、SNPマイクロアレイまたはチップが開発され、研究に迅速に採用されました。

Q：どの種のアレイを開発しましたか？

JM：私はイルミナの50Kディア、50Kおよび600Kシープアレイ、および約5つの低密度シープアレイの開発に直接関わってきました。

家畜のゲノム選択におけるアレイの価値は何ですか？

JM：イルミナのアレイは驚異的なテクノロジーに基づいています。主な利点は、再現性のある高品質の結果が得られることです。DNAが分解されない限り、DNAは堅牢で、サンプル処理も高速です。

Q：アレイの限界は何ですか？

JM：アレイの限界の1つは、遺伝的多様性が高い種のアレイを設計することが難しいことです。非常に多様な種を一緒に栽培する人もいます。例えば、スコットランド産の赤鹿とカナダ産の豚が飼育されているため、設計に特に注意を払わない限り、ほとんどのアレイで深刻な確認バイアスが発生します。

アレイの主な限界は、少数の個人が遺伝子型解析を受ける小さな種では、アレイの開発コストが高いことです。また、アレイがコスト効率の高いものとなるには、多くの個人の遺伝子型を決定する必要があります。

"GBSは、エントリーコストが低く、ジェノタイピングが安価であり、補完を行う必要がないため、アレイではなく選択しました。"

Q：GBSの使用を開始したのはいつですか？

JM：2011年初め、特に遺伝的多様性の高い種ではSNPチップが費用対効果が高いとは考えられないことに気づきました。いくつかのGBS戦略があり、私たちが選択した戦略は、コーネル大学のBuckler Maize Genetics and Diversity Labによって開発されました。¹この手法を修正し、より安価で使いやすいものにしました。

Q：GBSはコストとリソースベースでアレイと比較してどうですか？

JM：コストベースでは、30,000～100,000のSNPを使用するGBSは、牛のような主要な種で低密度アレイを使用するのとほぼ同じ価格です。GBSでゲノム選択データを適切な方法で解析すれば、補完も必要なく、リソースと時間のコストを削減できます。例えば、集団のジェノタイピングでは高密度アレイと低密度アレイの混合物がよく使用されます。ゲノム選択解析を行う前に、低密度アレイを高密度ジェノタイプに転写するにはインピュテーションが必要です。そもそも高密度のジェノタイプがあるので、GBSではそうする必要はありません。これは処理時間の大幅な節約であり、大規模で高密度なトレーニングセットを必要としないことを意味します。

Q：ゲノム選択におけるGBSの価値とは？

JM：大きな利点がありますが、気が遠い方には適していません。アッセイの最適化とソフトウェア開発にかなりの時間を費やし、その成果を享受しています。

GBSの最初の利点は、開発コストが低いことです。2つ目は、高い発散性を持つ種を扱うことです。3つ目は、解析対象の種のリファレンスゲノムがない場合に使用できます。第四に、バリアントに適切な発見ステップを用いると、発見とジェノタイピングを同時に実施できるため、確認バイアスの問題が軽減されます。最後に、同じシステムを使用して多くの種を同時に解析できるため、ワークフローが進行した後でGBSを実行する方が安価です。これにより、複数の生物種に対して同じラボプロトコールを使用できるようになります。その結果、同じライブラリーと同じシーケンスレーンに異なる種からのサンプルを持つことができます。バイオインフォマティクスを使用してサンプルと種をデコンボリューションします。

"プロジェクトは約3か月で完了しました。GBSの開発には1～2か月かかり、シーケンスの所要時間は4～6週間でした。"

Q：ゲノム選択の情報提供にGBSを使用したのはどの種ですか？

JM：当初、専門知識を発展させていたときに、牛や鹿にGBSを使用しました。レッドディア、ライ麦草、ホワイトクローバーのメソッド開発も進めました。2014年には、他の種に分断し始めました。今日、約50種のGBSワークフローを開発しました。

Q：Meredith Dairyヤギ群れにGBSをどのように使用していますか？

JM：GBSを使用して、群れ内のすべての個人を遺伝子型解析しています。数千頭の動物がいると、乳牛の群れの家系を記録するのは非常に困難です。その結果、群れ内の個人が利用できる家系データはなく、牛乳の生産記録のみがありました。飼育場（雄ヤギ）には品種値がないため、飼育場の飼育場の選択は臨時でした。群れ全体をジェノタイピングすることで、どの群れ（雌のヤギ）が、測定されるすべての形質に対して最良の育種値を持っているかを正確に知ることができます。また、どのバックが最も多くの牛乳を生産している娘を残しているかも知っています。当社の知る限り、このサイズのヤギのプロジェクトにGBSを使用したのは今回が初めてです。

Q：このゲノム選択プロジェクトにGBSを選んだ理由は何ですか？

JM：GBSは、エントリーコストが低く、ジェノタイピングが安価であり、補完を行う必要がないため、アレイではなく選択しました。50Kヤギのアレイは、小さなヤギの群れのゲノム選択に使用するには費用がかかります。手頃な価格を得るには、多くのチップを購入する必要があります。

一方、ヤギのGBSの開発には約3,500米ドルかかります。50,000以上のSNPを使用し、動物1匹あたり約18米ドルで群れのジェノタイピングを行いました。その価格にはDNA抽出と育種価値の決定が含まれます。

"GBSは、誰かが改善したい作物や種に対してゲノム選択を可能にし、費用対効果を高めます。"

Q：ヤギ群れのGEBVの評価にGBSをどのように使用しましたか？

JM：生のGBSリードをバイオインフォマティクスパイプラインに通し、結果を処理してバリアントを同定しました。GBSの結果は、ジェノタイプではなく生のコール番号です。例えば、バリアントAの2つのリードとバリアントBの1つのリード、またはバリアントAの3つのリードとバリアントBのなし。

ローカバレッジシーケンスでは、SNPだけをピックアップするのではありません。SNPコーリングパイプラインからのGBSデータには、構造バリアント、遺伝子重複、固定変異、または異常な遺伝パターンが含まれます。Ken G. Doddsが開発したソフトウェアを使用してデータを処理します。KGDソフトウェアは、不正確なSNPコールとヘテロ接合体のアンダーコールをゲノム関係マトリックスに変換します。² ゲノム関係マトリックスは、SNPチップから開発された家系に相当します。育種値の計算には、ゲノム関係情報と、牛乳の収量、組成、生量などの生産量測定値を使用します。

個々の記録は群れ全体で使用され、その個人が他のすべての人々からどれだけ離れているかに基づいて個々のGEBVを推定します。ジェノタイピングされた動物の家系記録が混在することもあります。この場合、シングルステップの最良線形偏りなし予測因子（ssBLUP）を使用して、家系マトリックスと関係マトリックスを結合します。私たちが持っている情報は、ジェノタイピングされた動物からの情報だけである場合もあります。このような場合、ゲノム関係マトリックス（GBLUP）のみを使用します。

Q：Meredith Dairyプロジェクトの完了にはどのくらいの時間がかかりましたか？

JM：プロジェクトは約3か月で完了しました。GBSの開発には1～2か月かかり、シーケンスの所要時間は4～6週間でした。また、約9,000頭の群れの個人からサンプルを入手するなど、プロジェクトの目標を決定し、ロジスティクスを整理する時間もありました。

Q：Meredith Dairyの群れに関してあなたが提供したデータについて、Meredith Dairyはどのような感じでしたか？

JM：Sandy Cameronは、GBSを使用して提供したゲノム情報に非常に満足しています。生殖医学の博士号を持つ獣医です。突然、彼は胚移植やその他の生殖に関する決定を知らせ、ゲノム選択をサポートするツールを持っています。

Meredith Dairyも垂直統合されています。乳製品にはヤギの群れがあり、ブランドチーズを販売しています。その結果、遺伝子改善の経済的なメリットを最大限に享受できます。

" HiSeq−(* 2500システムは優れた性能を発揮しており、得られたデータに非常に満足しています。サンプルの再測定はめったにありません。つまり、前もって処理することは良好です。"

Q：GBSを実施するためにどのようなシーケンスシステムを使用していますか？

JM：101塩基対リードのHiSeq 2500システムのシングルレーンを使用します。HiSeq 2500システムは優れた性能を発揮しており、得られたデータに非常に満足しています。サンプルの再測定はめったに必要ありません。つまり、前もって処理することは良好です。フローセルは週に1～3個、フローセルには約3,000個のサンプルがあります。

Q：データの解析にはどのソフトウェアを使用しますか？

JM：データは標準的なイルミナソフトウェアで処理され、FASTQファイルが作成されます。QCパイプラインからSNPコールまで、ソフトウェアはGitHubで開発されました。³ 既存のソフトウェアからほとんどのパイプラインを構築しました。私たちが開発した唯一の新しいソフトウェアは、生のGBSデータを処理するKGD遺伝学ソフトウェアです。GitHubでも入手できます。

Q：このGBSプロジェクトの次のステップは何ですか？

JM：商業的な遺伝子改善のためにGBSを使用している植物と動物の種は6種類あります。また、GBSを使用して、ニュージーランド原生種の保存遺伝学を支援しています。これらのプロジェクトでは、GBSを使用して、島間の集団が相互繁殖しているかどうかを判断し、特定の島の集団に遡るキャッチアニマルを追跡しています。

Q：今後、マイクロアレイよりもGBSを選ぶ際のヒントとなるのは何だと思いますか？

JM：ソフトウェアが改良され、シーケンスのコストが下がるにつれ、人々は低いカバレッジで個人のシーケンスを開始します。そこで、シーケンスのコスト削減は大きな効果をもたらします。現時点では18～20米ドルの価格帯です。時間の経過とともに、サンプルあたり約12米ドルまでコストが徐々に下がると思います。今後5～10年間は、現在の機会で人々が忙しくなります。

Q：GBSは、孤児の作物や小さな家畜種の育種選択プログラムを実施する上で、どのようなメリットをもたらしますか？

JM：GBSの利点は、孤児の作物や小さな家畜にとって重要です。GBSは、誰かが改善したい作物や種に対してゲノム選択を可能にし、費用対効果を高めます。

ニュージーランドは、高品質の食品の輸出に大きく依存する小さな国です。乳羊、ベニソン、乳羊、太平洋産サーモン、貝類ムール貝、アジタミ（モントレーパイン）、キウイ、リンゴ、アボカドなど、海外で販売する製品の基盤となる小さな種が数多く存在します。成功し、競争力を維持するためには、これらすべてのゲノム改善が必要です。

Q：ゲノム選択に加えて、GBSは研究においてどのような利点をもたらしますか？

JM：GBSはさまざまな方法で使用できます。ゲノムアセンブリを支援し、GWASまたはDNA親子研究を実施して品種や系統組成を推定するためのリンケージマッピングに使用できます。また、トレーサビリティや原産国ラベル付けにGBSを使用することもできます。重要な課題は、GBSデータを効率的に解析するためのこれらのアプリケーション用のソフトウェアを開発することです。