プレシジョンオンコロジー研究への単一薬剤アプローチを超えて

はじめに

Avera HealthのCenter for Precision Oncologyでは、サウスダコタ州スーフォールズ、Brian Leyland-Jones, MD, PhDに拠点を置く地域の医療システムであり、博士と彼のチームは、疾患を診断し、がん治療の決定に情報を与える可能性のあるバイオマーカーを特定、プロファイリング、検証するための臨床研究を行っています。Leyland-Jones博士と密接に連携して、カリフォルニア州ラホヤのBowden Precision Oncology Clinical Laboratoryの分子および実験医学シーケンスディレクターであるBrandon Youngです。彼らは共に、DNAとRNAの次世代シーケンス（NGS）研究、およびプロテオミクス腫瘍解析を実施して、実験的な薬剤の組み合わせをデザインしています。

彼らのアプローチのトランスクリプトーム要素は不可欠です。彼らは、単一のDNA変異を対応する薬剤にマッチングさせるという従来のモノ製薬アプローチに限定したくはありません。“3剤併用療法がHIVと結核に有効であるのと同様に、3剤以上の薬剤併用療法はがん治療に有効である可能性があると考えています”とYoung氏は述べました。“RNAシーケンス（RNA-Seq）により、特定の生物学的経路が関与しているかどうかを判断することができます”とLeyland-Jones博士は付け加えました。基本的なDNAから活性化されたパスウェイのトランスクリプトームシグネチャーに移行することで、がん内のタンパク質レベルで実際に起こっていることにはるかに近づくことができます。

iCommunityは、Leyland-Jones博士とYoung氏と話し合い、彼らの研究目的、進行中のRNA-Seq研究、がん医学におけるNGSの将来に対する彼らのビジョンについて話し合いました。

Brian Leyland-Jones, MD, PhDは、Avera Cancer Institute Center for Precision Oncologyの腫瘍学/血液学者であり、Brandon YoungはBowden Precision Oncology Clinical Laboratoryの分子および実験医学シーケンスディレクターです。

Q：研究の主な焦点は何ですか？

Brian Leyland-Jones（BLJ）：腫瘍はクローン性であり、腫瘍を駆動する各細胞集団間にはクローン依存性があります。すべてのクローンドライバーを閉鎖する3剤または4剤の組み合わせを探しています。これは非常に積極的なアプローチです。米国で最大規模の第I相臨床試験の1つを開発したRazelle Kurzrock博士を除き、ほとんどの学術センター^では、被験者を単剤治療研究にマッチさせるためにシーケンスを使用しています。

Q：なぜAvera Healthに入社したのですか？

BLJ：私の11名のチームは、2013年後半にAvera Healthに連絡を取り、当社のシーケンスの専門知識に喜んで対応してくれるかどうか確認しました。最先端の腫瘍学環境と、がん被験者シーケンスデータベースの開発のサポートを探していました。今では約700人の個人をシーケンスしました。

Q：Avera Healthの本社があるSouth Dakotaではなく、サンディエゴのシーケンスラボであるのはなぜですか？

BLJ：私はBrandon Youngと10年近く提携しています。サウスダコタ州での課題の1つは、この分野で専門性の高いゲノムおよび臨床試験の人材を募集することが難しいことです。しかし、La Jollaのメサ島で作業をしている場合は、イルミナ、その他何百ものバイオテクノロジー企業、カリフォルニア大学サンディエゴ校、Scripps Research Institute、Salk Institute、Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Instituteの隣に座っています。La Jollaの拠点では、サンディエゴ地域の他のバイオテクノロジー企業とのコラボレーションを行うことができます。Worldwide Innovative Networking（WIN）コンソーシアムは、当社のLa Jollaラボをその精密な腫瘍学ラボのグローバルハブとして使用しています。

"同じ一連の臨床サンプルを採取し、NextSeq 500 SystemのRNA-SeqとTruSeq RNA AccessをNanoString nCounterダイレクトハイブリダイゼーションテクノロジーで比較しました。"

Q：腫瘍RNAシーケンスの価値は？

Brandon Young（BY）：DNAシーケンスは従来より実施が容易でした。NCI-Match*やStand Up To Cancerなどの従来のプログラムは、単一のDNA変異を単一の薬物療法と相関させることを目指しています。当社の多剤併用アプローチには、より多くの情報が必要です。どの薬剤が効果的に組み合わせて使用されるかを判断するには、複数の方法からの情報が必要です。

がんにはいくつかの主要なネットワークとパスウェイがあります。HIVと結核に対する3剤併用療法とほぼ同じ方法で、3剤併用療法はがん治療に有効である可能性があると考えています。RNA-Seqを用いた発現プロファイリングにより、血管新生に関与するものなど、特定の生物学的経路が上方制御され、組み合わせアプローチで可能性のある標的となるかどうかを決定することができます。

DNA変異は、常に発現していない可能性があるため、必ずしも十分ではありません。したがって、RNA-SeqはDNA解析ベースのアプローチが機能するかどうかを教えてくれるかもしれません。融合には指示された治療が存在するため、融合自体が実際に発現しているかどうかを知りたいと考えています。RNA-Seqは、腫瘍生物学の全体像を示す貴重なツールです。同様に、プロテオミクスとタンパク質のリン酸化も重要であると考えています。

DNAシーケンスは絶対的に基本的なものであり、特にがんの疾患状態を特定するために実施する必要があると考えています。RNA-Seqは、単に変異を調べ、薬と一致させるためだけにとどまらない情報を提供する重要な補体です。

BLJ：HER2コピー数、HER2蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）比、または定量的免疫組織化学（IHC）などを見ると、これらすべてが相関し、ハーセプチンの恩恵を受けます。しかし、現在、最適なマーカーは転写産物レベルです。ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）経路の変化を伴う腫瘍学の症例では、私たちの研究により、活性との最良の相関関係はDNAレベルではなくホスホプロテオミクスレベルにあることが示されています。そのため、転写産物レベルまたはタンパク質レベルにさらに上がれば、はるかに良いものになると考えています。コロンビアのAndrea Califanoとのコラボレーションにより、活性化パスウェイのトランスクリプトームシグネチャーを開発しました。DNAから転写シグネチャに移行することで、がん内のタンパク質レベルで実際に起こっていることにはるかに近づくことができます。

Q：ハイブリダイゼーションアプローチではなくシーケンスを使用する理由は何ですか？

署名：10年前、Brianと私はイルミナのマイクロアレイテクノロジーを使用して、10歳の臨床試験サンプルのレトロスペクティブ解析を始めました。そのアイデアは、戻ってレスポンダーとノンレスポンダーを比較することでした。NGSが導入されたとき、HiSeq−(* 2500システムを使い始めました。また、TruSeq−(* RNA Access Library Prep Kit ^†を研究で使用した最初のグループの1つでもあります。

マイクロアレイで8,000～10,000のサンプルを解析し、RNA-Seqを用いて数百のサンプルを解析しました。重要な問題の1つは、常にコストです。400～500のサンプルを測定する場合、トランスクリプトーム全体のシーケンスコストがかかります。イルミナは、DNAとRNAのシーケンス情報を統合した補完的アプローチの価値を理解しました。TruSeq RNA Accessは、これらの研究をより経済的に実施できるように開発されました。

"RNA-Seqは、私たちが現在言っている“臨床上関連性がある”以上のことを行い、コラボレーションのための追加データを持ち、後で振り返るチャンスを自分に与えたいかどうかを選択するのに最適な方法です。"

Q：RNA-Seqとハイブリダイゼーションベースのアプローチの利点を比較しましたか？

署名：アプローチにとらわれないようにしたいと考えたため、プラットフォーム比較研究を実施して、異なるプラットフォームを使用するためのデータタイプ、データ品質、コストに関する知識のギャップを明らかにしました。同じ臨床サンプルを採取して、NextSeqSeq RNA AccessとNanoString nCounterダイレクトハイブリダイゼーションテクノロジーを搭載したNextSeq 500システム上でRNA-SeqとTruSeq RNA Accessを比較しました。我々は、サンプルあたりのNanoString nCounterコストがRNA-Seqの実施コストの半分であることを知っていました。両方のプラットフォームで同じサンプルを実行した場合、同じ発現プロファイルが得られるかどうかを決定したいと考えました。

相関は0.98～0.99の範囲で非常に高いことがわかりました。したがって、770遺伝子のNanoString nCounter PanCancer Pathways Panelの遺伝子と、TruSeq RNA Accessトランスクリプトームシーケンスアッセイの同じ遺伝子を比較した場合、NanoStringのコストは低く、770遺伝子の発現プロファイルは同じになります。

しかし、コストとカバレッジは別の問題でした。PanCancer Immune Profiling PanelとPanCancer Pathways Panelを組み合わせると、合計約1,200の遺伝子の転写データが得られました。これらのPanCancerパネルの組み合わせのコストは、TruSeq RNA Accessの実行と同程度でした。しかし、TruSeq RNA Accessは、これらの1200の遺伝子と、これらのパスウェイに関与する別の20,000の遺伝子をカバーしています。また、融合コールを見ることもできます。

TruSeq RNA Accessから取得した、同量のお金と同量のRNA出発物質に関する豊富なデータから、イルミナのプラットフォームを選択することで得られる機会が増えたことがわかりました。RNA-Seqは、私たちが現在、臨床的に関連性があると言っている以上のことを自ら行い、共同研究や後日振り返る追加データを得る機会を得たい場合に選択する適切な方法です。

Q：NextSeq 500システムを選んだ理由は何ですか？

署名：4年前にLa Jollaシーケンスラボを設立した際、当初の計画はHiSeq 2500システムを使用することでした。その頃、イルミナはNextSeq 500システムを導入しました。Brianと私は、その仕様と能力を確認し、NextSeq 500システムが分子病理ラボのシーケンスの主力になると結論付けました。そこで、ラボにこれを選んだのです。

Q：NextSeq 500システムにはどのような利点がありますか？

署名：コア施設に関するこれまでの経験では、HiSeq 2500システムのフルキャパシティを経済的に使用するのに苦労していました。1週間に4、5、または10サンプル、翌週には3サンプルを採取することがあります。HiSeqのレーンを充填するには8つのサンプルが必要ですが、迅速なターンアラウンドを提供する必要がある場合は、サンプルをバッチ処理できるようにサンプルが蓄積するのを待つことはできません。1台のHiSeqシステムの価格で、2台の独立したNextSeqシステムを持つことに気づきました。1つのNextSeqシステムがDNAを稼働し、もう1つはRNAを稼働し、またはRNAとDNAを一緒に稼働させることができ、大量のサンプルが得られるまで待つ必要がありませんでした。

そのため、NextSeq 500システムを選択する決定のほとんどは、RNAおよびDNAシーケンス装置のスループットをサンプルが入ってくる方法と一致させる柔軟性と、迅速なターンアラウンドを提供する能力を持つことでした。さらに、キャプチャーテクノロジーと全トランスクリプトーム解析に重点を置いているため、全ゲノムシーケンスに重要な要件はありませんでした。一部のグループは、HiSeq 2500システム、またはNovaSeq−(* 6000システムの高いスループットとコスト効率から、本当に恩恵を受けることができます。しかし、当社のようなラボでは、NextSeq 500システムにより、迅速なターンアラウンドと、一度に経済的により少ないサンプルしか実行できないという利点があります。

"TruSeq RNA Accessから取得した同量のお金と同量のRNA出発物質の豊富なデータから、イルミナのプラットフォームを選択することで得られる機会が増えたことがわかりました。"

Q：ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）保存サンプルはどのように処理しますか？

署名：最初にこの作業を開始したとき、私はサンプルを提供した病理学部門と愛情/憎悪関係があったと冗談を言いました。常にFFPEを使用してサンプルを保存していました。研究のバックグラウンドから来たので、新鮮で凍結したサンプルが欲しかったのです。過去5年間、私たちはFFPEサンプルを持つことの価値について考え、理解してきました。

FFPEの保存により、腫瘍の不均一性に対処することができます。病理医はFFPEスライドを検査して、腫瘍含有量が最も多い領域を定義することができます。その特定の切片を解析用に切り取ることができ、また、隣接する正常組織をスライドから取り出し、それを対照として使用することができます。

Q：FFPEサンプルの品質は向上しましたか？

署名：FFPEサンプルがより実行可能である理由の1つは、私たちが現在取り扱っているFFPEサンプルの品質です。1960年代から1970年代までの数十年前のサンプルを見ていた人々が直面する課題とは異なり、通常は生検実施から1か月以内にRNAとDNAを抽出しています。また、現在私たちが使用している脱パラフィンプロトコールはより穏やかで、RNAをよりそのままにしています。サンプルが分解されているため、断片が100塩基対未満であり、解析できないのを目にしてから、非常に長い時間が経ちました。

TruSeq RNA Access、さらには全トランスクリプトームキットでは、最初のステップは通常、RNAの断片化です。FFPE保存はRNAを断片化し、アッセイのステップを節約します。多くの場合、抽出したRNAは十分に保存されているため、断片化ステップを実行する必要があります。FFPEプロトコールとイルミナのライブラリー調製キットは、FFPE組織がそれほど困難ではないような方法で進化してきました。

Q：腫瘍の不均一性を区別する他の方法を見ましたか？

署名：レーザーキャプチャーのマイクロダイセクションにこだわってきました。レーザーキャプチャーにより、優れた技術者は1日に数個のサンプルでマイクロ解離を行うことができます。細胞が捕捉膜に接着する方法により、抽出がより困難になります。標準的なマイクロ解離は、それほど選択的ではありません。しかし、優れた病理学者は、5～10分でヘモトキシリンおよびエオシン（H & E）染色スライドの腫瘍切片を丸で囲むことができます。メスまたはカミソリの刃で手でマイクロダイセクションを行うには、さらに1分かかります。外科的切除の場合、必要な部品を切り取るのではなく、不要な部品を切り取って、サンプルの複数の部分から腫瘍コンテンツを取得します。

そうすると、シーケンスの深さが問題になります。これは、インフォマティクスチームと密接に連携して取り組むことです。アッセイパラメーターとTruSeq RNA Accessトランスクリプトームシーケンスにマップされるリード数に基づいて、必要なだけリード数を確保したいと考えています。これらはすべて、アッセイそのものに対する私たちの信頼と、その不均一性に対処できる能力の要因となります。技術的観点から、TruSeq RNA Accessは、コストとデータの観点から最大の利益を得るため、既知のトランスクリプトームにフォーカスする能力を最大限に発揮する優れた仕事をしています。

"...NextSeq 500システムを選択する決定のほとんどは、RNAおよびDNAシーケンス装置のスループットをサンプルが入ってくる方法と一致させる柔軟性と、迅速なターンアラウンドを提供する能力を持つことでした。"

Q：腫瘍の不均一性を判断するためにシングルセルシーケンスの実施を検討したことがありますか？

署名：シングルセルシーケンスにはユニークな価値があると思いますが、コスト効率の高い方法で実施できる点はまだありません。問題の1つは、100,000～500,000個の細胞に対してRNA-Seqを実施していることです。これは、病理スライドから得られるものとほぼ同等です。FFPEサンプルから多くの個別細胞を調製する効果的な方法はありません。シングルセルデータを見てきましたが、不均一性に対処する方法に関しては素晴らしいように見えます。しかし、腫瘍解析の観点から自信を持てるよう、分離とシーケンスが必要な細胞数は膨大であるため、困難です。ブライアンと私は、新しいテクノロジーの開発、リリース、改善について常に情報を得ています。トランスレーショナルリサーチに焦点を当てながら、この分野を成熟させます。

BLJ：現在、組織と血液のDNAターゲットシーケンスを実施しています。その組み合わせを使用して、ある程度の不均一性を補正します。循環腫瘍細胞（CTC）とセルフリーDNA（cfDNA）の複合解析を行うグループがいくつかあります。CTCがどこに入るか、トランスクリプトミクスとプロテオミクスがどこに入るかという疑問に答える必要があります。これらは、シングルセルシーケンスレベルでの解析よりも、現時点ではより重要な質問だと思います。

Q：がん医療におけるシーケンスの将来の役割

署名：DNAシーケンスは、5年ではないとしても、10年後には標準的手法になると考えています。RNAについても同じだと思います。

BLJ：今後5年間で、シーケンスはがん解析における従来の放射線学と病理学と並行して行われます。これは、クリニックに急速に組み込まれる技術です。最近の患者支援会議で、Kurzrock博士は、医師ががん患者の組織サンプルのシーケンスを実施しない場合、5年後には医療過誤とみなされると述べました。

これらのアッセイは、最終的にはすべての病院の分子病理学ラボで実施されると私は考えています。今や臨床検査室に生化学検査や血液学アッセイシステムがあるように、すべての病院の分子病理検査室にはシーケンスプラットフォームがあると思います。TruSeq RNA Accessの導入により、この移行の準備が整いました。

何年にもわたり、DNAシーケンス解析からトランスクリプトミクスやプロテオミクスに移行していきます。DNAレベルでのターゲットシーケンスパネルが常に使用されます。しかし、融合、microRNA、および発現レベルを評価することは、より重要になります。

イルミナのプラットフォームは、今後5年間で腫瘍学が進む分野であると考えています。