がんにおける長鎖ノンコーディングRNAの役割を解読する

はじめに

Jo Vandesompele博士は、RNAに特に親和性があります。博士論文研究から始まり、神経芽腫におけるRNAの役割を研究するために逆転写酵素定量PCR（RT-qPCR）を使用しました。それ以来、RNAに夢中になっています。ヘント大学の機能的がんゲノミクスグループと、2007年に設立されたBiogazelleが焦点を当てており、RNA解析と実験デザインサービスを提供しています。

RNAは魅力的な分子だと思います。彼は、会議でそのプレゼンテーションを聞いた後、特定のタイプのRNA、長いノンコーディングRNA（lncRNA）に焦点を合わせたレーザーになりました。lncRNAは、ヒトの体内の多数の専門細胞の原因であり、細胞がどのように転写的に組織化されているかを調整すると考えられています。特定のがん細胞は、特定のlncRNAの存在に中毒しているように見え、転写産物がサイレンシングされると死滅します。私たちはすぐにlncRNAの力を認識し、さまざまなライブラリー調製法を用いてこれらの転写産物と、さまざまながんにおけるその役割を研究し始めました。ヘント大学とBiogazelleのチームは、lncRNAの世界的専門家として認められています。

iCommunityはVandesompele教授と、DNAマーカーのみに焦点を絞るのではなく、がんを理解する上でのlncRNAの価値、およびそれらが新しいがん診断と治療法の開発のターゲットとしてどのように使用できるかについて話しました。また、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織サンプルやリキッドバイオプシーなど、高度に断片化されたサンプル中のRNAマーカーを同定するために、NextSeq−(* 500システムとTruSeq−(* RNA Exomeをどのように使用しているかについても話し合いました。

Jo Vandesompele博士は、ヘント大学の教授であり、Biogazelleの共同創業者兼最高科学責任者です。

Q：RNA、特にlncRNAに関心を抱いたきっかけは何ですか？

Jo Vandesompele（JV）：小学校で神経芽腫の研究を行ったとき、RNAに興味を持ちました。原発細胞にアクセスしたかったのですが、希少細胞でした。ノーザンブロットやマイクロアレイにはRNAが過剰に必要であったため、当時の新規手法であったRT-qPCRを使用しました。

2009年にKeystoneの会議に参加し、最初にlncRNAについて知りました。その時点で、約1700のlncRNAシーケンスのみが同定されました。lncRNAのパワーをバイオマーカーとして認識し、それを定量化するためのqPCRアッセイを設計しました。当社の取り組みと世界中の研究者の努力により、lncRNAデータベースは4,000に、その後18,000シーケンスに成長しました。

Q：lncRNAの研究にどのような技術を使いましたか？

JV：lncRNAデータベースが成長するにつれ、qPCRはもはや効率的なアッセイではないことが明らかになりました。マイクロアレイをデザインし、異なるライブラリー調製法を用いてトータルRNA-Seqに移行しました。当時、トータルRNA-Seqを実施していた研究者は多くありませんでしたが、現在もそうです。ほとんどの研究者はpolyA RNA-Seqに依存していますが、ポリAテールのみでRNAを捕捉しています。我々は、lncRNAの半数にはこのような尾がないことを推定しています。

Q：人体におけるlncRNAの役割は何ですか？

JV：ヒトの体におけるlncRNAの役割を理解する上で、表面を傷付けているだけです。実験を行う際に浮上しているテーマの1つは、lncRNAの極限の組織と細胞タイプの特異性です。lncRNAは、ヒトの生活の複雑さを説明できる可能性があります。ハエ、トマト、ヒトはかなり異なりますが、タンパク質コード遺伝子の数はほぼ同じです。しかし、ヒトは、全身に多くの特殊な細胞型を持つ、はるかに複雑です。研究者は、これが代替的なスプライシングまたは翻訳後タンパク質の修飾によるものであると考えていました。これはある程度当てはまるかもしれません。しかし、転写制御の観点から、lncRNAは細胞がどのように構成されているかを調整する上で重要な役割を果たしていることは明らかです。lncRNAは、タンパク質をDNAに取り込むか、タンパク質をRNAに付着させるか、異なるRNA分子を足場に糊付けするかのどちらかで、糊として機能すると考えています。もう1つの可能性は、本来あるべきではない場所から重要な分子を滴定したり、必要な場所に移動させたりすることです。

"lncRNAの発現特異性を利用して、細胞の状態を明らかにすることができます。"

Q：lncRNAは、細胞の状態についてどのようなことを教えてくれますか？

JV：lncRNAの発現特異性を利用して、細胞の状態を明らかにすることができます。現在までに約50,000のlncRNAが特定されており、その数は増加しています。lncRNAは発現の時間と場所において非常に特異的であり、任意の細胞タイプで発現されるのはごくわずかな分画のみです。特定のlncRNAが発現する時期と場所のコードがわかったら、細胞の種類と、それが健康か疾患かなど、細胞の状態を特定できます。これらの細胞タイプの特異性を調べることで、多くのことを学べます。

Q：診断および治療開発のバイオマーカーとして、lncRNAをどのように使用できるでしょうか？

JV：lncRNAが特定の細胞または組織で特異的に発現する場合、その細胞で重要な機能を持つ必要があると想定するのは論理的です。一部の細胞、特に特定のがん細胞は、存在するlncRNAに中毒されることがわかりました。最初に同定されたlncRNAの1つはSAMMSONで、皮膚黒色腫でのみ発現しました。協力者とともに、SAMMSONのサイレンサーは特定のミトコンドリア機能を破壊し、がん細胞を死滅させることを発見しました。¹

SAMMSONは、何百ものがん細胞タイプの1つである、特異的なlncRNAです。この細胞を除去すれば、がん細胞は不幸になり、増殖も死もなくなります。lncRNAに対して合理的な薬剤設計を行い、治療法を開発し、同時にコンパニオン診断を行うことができます。lncRNAシーケンスがわかっており、それを測定するためのアッセイを設計できる場合、これらのlncRNAに中毒する疾患やがん細胞を特定し、サイレンシング技術を使用してシャットダウンすることができます。CRISPRおよびsiRNAベースのアプローチが開発中です。アンチセンスヌクレオチドは最も高度で、lncRNAターゲット療法の開発に有望なアプローチを提供します。

lncRNAは、腫瘍学、神経学、その他の疾患タイプの分野で有望です。Inotersen、nusinersen、eteplirsen、mipomersenなど、市販されているアンチセンス薬が少数あり、アンチセンスオリゴヌクレオチドを評価する100を超える臨床試験があります。このような薬剤は投与が簡単で、RNAを減少させたり、スプライシングを修飾したりすることで作用します。² 私たちはまったく新しいタイプの薬剤の始まりにいます。

Q：ゲント大学ではどのようなタイプのlncRNA研究を実施していますか？

JV：当初は小児がんに焦点を合わせていましたが、当社の技術はあらゆるタイプのがんに適用できることに気づきました。前立腺がん、黒色腫、卵巣がん、食道がん、肺がん、神経芽腫など、約12種類のがんに焦点を合わせています。当社は可能な限り幅広い研究を目指しており、これらの研究を進めるために専門家の協力者や主要なオピニオンリーダーと協力しています。

"ほとんどの研究者はpolyA RNA-Seqに依存していますが、ポリAテールのみでRNAを捕捉しています。我々は、lncRNAの半数にはこのような尾がないことを推定しています。"

Q：Biogazelleの顧客基盤の構成はどのようなもので、どのようなサービスを提供していますか？

JV：当社は主に製薬、バイオテクノロジー、および臨床研究の研究者と協力しています。当社は、RNAバイオマーカーの発見からカスタマイズされたRNA定量研究、ハイスループットのアンチセンスオリゴヌクレオチドスクリーニングの実施、lncRNAターゲットの同定、測定、サイレンシング、そして主要な創薬や前臨床研究でお客様を支援することまで、幅広いサービスを提供しています。

データを顧客に提供するだけではありません。プロジェクトを熟考し、実行可能な洞察と結果を提供し、プロジェクトを進めるお手伝いをします。当社には、すべてのプロジェクトディスカッションに関与し、実験計画を支援する博士レベルのプロジェクトマネージャーがあります。品質管理された環境で当社の手法を適用し、ISO 17025認定を受けており、医薬品の臨床試験の実施の基準（GCLP）にもとづいて機能します。これは製薬業界のお客様にとって非常に重要です。

また、イルミナと多くのインターフェースを取る研究部門もあります。このチームは、特にリキッドバイオプシーの分野では、これまで不可能だったことをお客様が実施できるような新しいRNA定量法の開発に注力しています。

Q：イルミナNGSシステムの使用を開始したのはいつですか？

JV：Ghent Universityの最初のNGSシステムは、Roche 454システムでした。DNA解析にのみ使用しました。人々は、使用が困難で費用がかかると苦情を言いました。ほぼ同時に、Genome Analyzer−(*_IIシステムを購入しました。2014年、当センターの診断ラボはMiSeq−(*システムを入手しました。彼らはとても満足しており、使いやすく、非常に手頃な価格だと考えていました。ほぼ同時に、BiogazelleチームはRNA-Seqを実施するためにNextSeq 500システムを購入しました。それ以来、2台目のNextSeq 500システムを買収しました。

Q：どのような種類のサンプルを解析していますか？

JV：当社が解析するサンプルの大半は、FFPE組織サンプルやリキッドバイオプシーなどの高度に断片化されたがんサンプルです。³ TruSeq RNA Exomeは、超低インプットRNAと高度に断片化されたRNAの課題を組み合わせたFFPEサンプルやリキッドバイオプシーサンプルに対応する優れたソリューションです。全RNAを既知の鎖起源のテンプレート分子に変換し、コードRNAのシーケンスキャプチャーを行います。他のトータルRNA調製法では、必ずしも意味のあるものではなく、より低品質のデータを生成するイントロンで多くのリードを消費します。

Q：サンプルを処理した後、十分なデータがあるかどうかをどのように判断しますか？

JV：すべてのステップで品質管理（QC）を行います。サンプル受領時に、量がラベルに顧客が記載していることを確認するために、量を確認します。FFPEサンプルでは、純度と完全性の点で定量化を行います。残念なことに、リキッドバイオプシーでは、レベルが低すぎるため、最初は完全性や純度にアクセスできません。液体生検でこれらを初めて検証できるのは、フラグメントアナライザーで前精製されたライブラリーを調べるためにcDNAをプレキャプチャーした時です。これは、あらゆるマイクロ流体装置で90%以上の時間で評価できます。時には解析を繰り返す必要があるため、十分なRNAがあることを確認するよう努めます。

濃縮とライブラリー精製の後、濃度の点で別のQCを行い、等モルプーリングがあることを確認します。これらのQCステップを通過した後、NextSeq 500システムでRNA-Seqを実施し、高品質のデータを取得します。

高品質のデータを生成することは非常に重要です。多くのサービスプロバイダーが気づいていないのは、シーケンスでバッチ効果が発生することです。これらを避けるために、私たちはサンプルをスクランブルして無作為化することを学びました。お客様がサンプルを送ってきた場合、常に特定の注文があります。そのため、サンプル受領時、抽出時、ライブラリー調製時にサンプルを無作為化し、バッチの影響を排除します。また、バッチ効果を導入しないように、品質とバッチ制御の試薬を用意しています。シーケンスの観点からは、できるだけ多くのサンプルを持つようにインデックス数を拡大しようとします。ほぼすべてのライブラリーについて、現在は最大96のインデックスがあり、一部のアプリケーション（例：3'-endシーケンス）ではさらに高いものとなっています。

"lncRNAシーケンスがわかっており、それを測定するためのアッセイを設計できるのであれば、これらのlncRNAに中毒する疾患やがん細胞を同定し、サイレンシング技術を用いてシャットダウンすることができます。"

Q：RNA-Seqを使用してサンプルに存在する変異を同定していますか？

JV：がんサンプルに存在する変異、スプライスバリアント、遺伝子融合を同定したいと考えていますが、多くの人は保守的で、遺伝子レベルの定量化のみを実行したいと考えています。

RNA-Seqデータの豊かさを生かしていないため、少し残念です。例えば、代替スプライシングは検出が容易です。また、現在では、バックスプライシングから生じるサーキュラーRNA（circRNA）と呼ばれる新しいタイプのスプライシングがあります。最近の3つの論文では、circRNAが治療標的または新規バイオマーカーとしての可能性が実証されています。^4-6  CircRNAは、polyAテールがないため、従来のpolyAシーケンスでは同定できません。そのため、人々はこれらに注意を払うことができませんでした。

当社は、RNA-Seqデータで他の変異も同定できるかどうかを調べるために、この技術を推進しています。顧客はDNAレベルでの価値を理解しています。RNAレベルでは異なるボールゲームです。例えば、RNA編集は交絡現象ですが、興味深い現象です。疾患生物学におけるRNA編集の重要性を理解し始めたばかりだと思います。しかし、カバレッジは各遺伝子の発現レベルに依存するため、RNAのダイナミックレンジは問題です。低頻度の変異を十分な感度で検出したい場合、低存在量のRNAを30倍カバーする必要があります。上位の豊富な遺伝子ですべてのシーケンスリードを消費します。

Q：RNA編集のアプリケーションにはどのようなものがありますか？

JV：RNA編集は、腫瘍変異量（TMB）の評価に有益である可能性があります。TMBは、がん細胞が担持するすべての変異を測定し、免疫腫瘍学療法に対する応答または応答の欠如を予測するために重要です。

研究者は、おそらく非常に簡単なため、DNAレベルでTMBを研究しています。RNAの課題ではありますが、実行可能で価値があります。TMBの高い腫瘍細胞は、より多くのネオアンチゲンを有し、これは免疫システムによって認識され、抗腫瘍反応を誘発することができます。非同義変異が発現し、したがってRNA-Seqデータで同定されると、RNA編集がネオアンチゲンの付加的な供給源として、ネオアンチゲンが生じる可能性があります。

我々には、発現TMB（eTMB）とDNAベースのTMBスコアとの間に強い相関関係があることを示す予備データがあります。パートナーと協力して、臨床データを用いた大規模な研究を行い、RNA編集から生じるネオアンチゲンの発現したバリアントを組み合わせると、チェックポイント阻害剤に対する反応のより良い予測因子が得られる可能性を示しています。TMBスコアは、タンパク質コード遺伝子のシーケンスされたメガ塩基あたりの非同義変異数であるため、アッセイ感度はそれほど重要ではありません。現在のTMBリキッドバイオプシー法では数百の遺伝子しか調べられません。RNA-Seqでは、より多くの遺伝子を調べることができ、より豊富なデータを得ることができます。このタイプの解析にRNAを利用するには、大きな可能性が見られます。

"RNA編集は、腫瘍変異量（TMB）の評価に有益である可能性があります。"

Q：Biogazelleはまた、前臨床研究で企業を支援していますか？

JV：創薬プログラムではRNAシーケンスを適用していますが、被験者をトリアージし、コンパニオンアッセイとして機能するための前臨床研究で使用する診断アッセイの開発については、qPCRに切り替えています。開発フェーズの1つでは、RNA-Seq探索研究で使用したのと同じサンプルを使用して、直交検証法としてqPCRを使用して結果を再現できることを確認します。当社のお客様やパートナーのほとんどは臨床グレードのアッセイを希望しており、qPCRで十分です。将来、この状況は変わるかもしれませんが、現在ではシーケンスを用いたRNAの臨床アッセイはあまり多くありません。qPCRを使用して、品質管理された臨床グレードの診断キットを作成できます。

Q：どのようなデータ解析を実施していますか？

JV：まず、サンプルまたはサンプルグループを比較する差次的遺伝子発現解析を行います。次に、2つの高度なバイオインフォマティクス手法を用いて遺伝子シグネチャを評価するため、RNAを調べる従来の方法を超えて進みます。1つ目は、Broad Instituteの遺伝子セットエンリッチメント解析アルゴリズムを使用した遺伝子セットエンリッチメント解析です。フォールドチェンジ差またはP値によって遺伝子をランク付けすることができます。これは、微妙なパターンを区別するための堅牢で高感度な計算手法です。遺伝子セットやパスウェイレベルの情報が明らかになり、サンプルグループで何が起こっているかを理解できるようになります。

2番目の方法は、RNAサンプルに存在する異なる細胞または組織タイプの寄与を推定するためのデコンボリューション解析です。腫瘍の大部分は、がん、間質、免疫細胞で構成されています。デコンボリューション法を用いて、腫瘍内の細胞の種類と割合を特定できます。また、この手法は体液にも適用されていますが、成功するかどうかは細胞や組織の種類に特徴的な遺伝子シグネチャの品質にかかっています。しかし、液体中のデコンボリューションの結果は明らかになっています。血漿、尿、および脳脊髄液（CSF）にさまざまな細胞型シグネチャーが認められ、これは有意義で経時的な変化を示しています。これらのRNAシグネチャは、がんが存在するか、再発したか、または寛解中かを示すために使用できます。これらの高度な解析手法を用いて、重要な発見が生まれることを期待しています。

Q：どのようなデータを顧客に提供しますか？

JV：当社が顧客に提供するデータは、顧客が回答を必要とする質問によって異なります。通常、遺伝子レベルの定量化データが必要です。しかし、スプライスバリアント、変異解析、RNA編集、および循環RNAデータに関するデータに対する要求は増加しています。顧客は、生データおよび処理済みデータを結果レポートとともに受け取ります。

"リキッドバイオプシー分野や腫瘍学分野以外では、RNA解析に重要な成長の機会があります。"

Q：疾患評価のためのRNA-SeqとDNAシーケンスデータの比較にはどのような価値がありますか？

JV：RNA-Seqデータは、DNAシーケンスと同じ、あるいはそれ以上ではないにしても、有益なデータを提供すると考えています。遺伝子発現解析に加えて、コピー数バリエーション^7、8、、変異⁷、RNA編集を決定し、T細胞受容体プロファイリング⁹と免疫細胞プロファイリングを実施できます。¹⁰ タンパク質コード領域を超えてlncRNAに目を向けると、バイオマーカーの可能性も大幅に高まります。20,000のタンパク質コード遺伝子と比較して、lncRNAでは50,000の潜在的遺伝子が存在します。最終的には、RNAとDNAのシグネチャーを一緒に調べて、がんや疾患サンプルを評価するという価値があるかもしれません。

Q：リキッドバイオプシー検査は今後どのように進化すると思いますか？

JV：DNA解析に基づくリキッドバイオプシー検査は、腫瘍学アプリケーションにおいて急速に成長しています。2019年プレシジョンリキッドバイオプシーカンファレンスで話したばかりで、リキッドバイオプシーのRNA解析の価値をうまく伝えることができたことを願っています。DNAだけでは、動的または応答性が十分ではありません。ctDNAは、がん細胞や存在する変異について何かを述べています。宿主が腫瘍にどのように反応しているか、または免疫系や間質細胞が腫瘍とどのように相互作用しているかについては何も書かれていません。小胞や血小板で何が起こっているかなど、RNA解析でこれらのシグナルを見ることができます。腫瘍教育された血小板に焦点を合わせた新しい分野があり、がんや心疾患などのさまざまなタイプのヒト疾患を治療するための精製された小胞の使用に関する新しい治療アプローチが開発されています。リキッドバイオプシーの分野や腫瘍学の分野以外では、RNA解析に重要な成長の機会があります。

Q：Biogazelleの成長における次のステップは何ですか？

JV：当社は、Biogazelleの顧客基盤をヨーロッパを超えて拡大し、独自のサービスを提供し続けることを望んでいます。当社は単なるRNA-Seqサービスプロバイダーではありません。当社は、実験を設計し、広範なバイオインフォマティクス解析を実施して、お客様にデータに関する洞察を提供し、貴重な診断と治療の開発における次のステップをサポートします。言葉を広めるだけです。

BiogazelleのRNA-Seqワークフローの詳細はこちら：

Biogazelleのケーススタディ

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参考文献

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