高度に断片化されたRNAサンプル中のlncRNAバイオマーカーの同定
lncRNAバイオマーカー同定のためのNextSeq 500システムおよびTruSeq RNA Exome Kit RNAシーケンスワークフローの最適化。
高度に断片化されたRNAサンプル中のlncRNAバイオマーカーの同定
まとめ
概要
Biogazelleは、FFPEおよびリキッドバイオプシーがんサンプル中のlncRNAおよびmRNA変異を同定するために、キャプチャーRNA-Seqを実行します。
課題
FFPEサンプルとリキッドバイオプシーサンプルは、超低インプットRNAと高度に断片化したRNAの課題を組み合わせています。
ソリューション
BiogazelleはNextSeq 500システムとTruSeq RNA Exome Library Prep Kitを選びました。イルミナはイルミナと協力して、キャプチャRNA-Seqワークフローの最適化、カスタムプローブの開発、および独自のキャプチャプロセスの実施を行っています。
利点
Biogazelleは、FFPEサンプルやリキッドバイオプシーサンプルからであっても、数ナノグラムのトータルRNAを用いて正確で高感度なlncRNA測定を行うことができます。
はじめに
RNAへの10年にわたる関心により、Jo Vandesompele博士は2007年にBiogazelleを発見しました。同社は、製薬、バイオテクノロジー、および臨床研究者にトランスクリプトーム解析と実験デザインサービスを提供しています。その幅広いサービスには以下が含まれます。カスタマイズされたRNA定量研究、ハイスループットのアンチセンスオリゴヌクレオチドスクリーニング、ロングコーディングRNA（lncRNA）ターゲットの同定、測定、サイレンサー、および主要な創薬と前臨床研究でお客様をサポートするRNAバイオマーカーの発見と検証。
ノンコーディングRNA研究は、Biogazelleの腫瘍学研究の中核をなしています。一部のがん細胞は、特定のlncRNAの存在に中毒し、転写産物がサイレンシングされると死滅すると考えられています。1ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルやリキッドバイオプシーサンプルの取り扱いは、これらのがんサンプルのインプット量が少なく、断片化が激しいため、困難になる可能性があります。Biogazelleは、NextSeq 500システムおよびTruSeq RNA Exomeキットを使用してRNA-Seqを実施し、これらのサンプルから最大限の情報を取得します。
Jo Vandesompele博士は、ヘント大学の教授であり、Biogazelleの共同創業者兼最高科学責任者です。
高度に断片化されたサンプルを最大限に活用する
Vandesompele教授によると、RNA-SeqにはNextSeq 500システムよりも優れた装置はありません。Vandesompele教授は、トータルRNA-Seqを実施するために必要な能力、柔軟性、規模があると述べました。また、多様なライブラリータイプをサポートするという点でも非常に寛容です。
これらのがん標本は非常に貴重です。Vandesompele教授は、マイクログラムまたは100ナノグラムのRNAを必要とする方法では生体材料を犠牲にしたくないと付け加えました。
Biogazelleはイルミナと協力し、さまざまなRNA-Seqアプリケーションに必要なサンプル量を削減します。Vandesompele教授は、RNA-Seqを成功に導くために、サンプルがどれだけ小さくできるかについて答えを求めています。10ナノグラムは効果がありますか？ 1ナノグラムはどうでしょうか？ RNA濃度を確実に測定することさえできないリキッドバイオプシーサンプルをシーケンスできますか？ 驚くべきことに、いくつかのシンプルで賢い修正では難しいことではありません。わずか数ナノグラムのトータルRNAまたはわずか200 μLのバイオフルードで、正確で高感度なRNA測定を行うことができます。2 これを実現するためのイルミナチームのサポートに感謝します。
NextSeq 500システムは、全RNA-Seqを実施するために必要な容量、柔軟性、および拡張性"を備えています。また、多様なライブラリータイプをサポートするという点でも非常に許容されています。"
課題を克服する
TruSeq RNA Exome Library Prep Kitは、超低インプットRNAと高度に断片化したRNAの課題を組み合わせたFFPEサンプルとリキッドバイオプシーサンプルに対応する優れたソリューションです。全RNAを既知の鎖起源のテンプレート分子に変換し、続いて関心のあるエクソンのシーケンスキャプチャーを行います。他のトータルRNA調製法では、意味のないイントロンのリードを多く消費し、品質の低いデータを生成します、とVandesompele教授は述べました。“RNA Exomeプローブベースのキャプチャー方法は優れており、魅力のように機能します。”
RNA Exomeの1つの限界は、プローブがタンパク質コード遺伝子のみをターゲットにすることです。“Total RNA-Seqを実施したとき、lncRNAはほぼノイズレベルであり、リードの95%は非常に豊富なコーディングタンパク質遺伝子になる”とVandesompele教授は説明しました。ソリューションとして、イルミナは、Ghent Universityで作成した包括的なヒトLNCipediaデータベースを使用して、これらすべてに対してカスタムプローブを開発しました。3これらの少量で困難なlncRNAをターゲットにしたカスタムプローブでキットを補完することで、素晴らしい実験を行うことができます。また、お客様がこれまで不可能だったことを研究できる数多くの可能性も開けています。これは素晴らしいことです。
“RNA Exomeプローブベースのキャプチャー方法は優れており、魅力のように機能します。”
低インプットサンプルのワークフローの変更
TruSeq RNA Exomeは少量のインプットを扱うのに適した技術ですが、BiogazelleはRNA分子に応じてワークフローにいくつかの修正を加えました。“RNAインプット量が少ない場合、サンプルの濃縮によるインプット量の増加など、いくつかの異なるトリックを適用します”とVandesompele教授は述べました。
Biogazelleチームは、TruSeq RNA Exomeでキャプチャーする前のマルチプレックスがリキッドバイオプシーの問題であることを発見しました。Vandesompele教授は、RNAの含有量が異なるため、当社のライブラリーは決して同質ではありませんと付け加えました。キャプチャー前のマルチプレックスではなく、サンプルごとに個別のキャプチャーを行います。作業量は増えますが、データは大幅に向上し、ライブラリーは等モルになります。
lncRNAは、腫瘍学、神経学、その他の疾患タイプの分野で有望です。全く新しいタイプの薬が登場しました。
ハイバリューRNA-Seq腫瘍学研究
Vandesompele教授は、RNA-SeqデータはDNAシーケンスと同じ、あるいはそれ以上ではないにしても有益なデータを提供すると考えています。バイオマーカーの可能性は、21,000のタンパク質コード遺伝子と比較して、49,000の高信頼のlncRNA遺伝子で有意に高くなります。しかし、この価値は、がんやその他の疾患を評価するために、RNAとDNAのシグネチャを一緒に調べることにあるかもしれません。“lncRNAは、腫瘍学、神経学、その他の疾患タイプの分野で有望である”とVandesompele教授は述べました。“まったく新しいタイプの薬が登場しました。”
BiogazelleでのRNA-Seq研究の詳細はこちら：
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参考文献
- Huarte MとRinn JL。大規模ノンコーディングRNA：がんにおける関連性の欠如？ Hum Mol Genet . 2010;19:152-161。
- バイオガゼル。専門知識/液体生検。 www.biogazelle.com/expertise/liquid-biopsies。アクセス済み。2019年6月17日
- LNCipedia。ヒト長鎖ノンコーディングRNAの包括的な公定書。lncipedia.org/. 2019年5月28日にアクセス。