NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.4により、データ品質と顧客ユーザビリティが向上

イルミナで最も強力なシーケンスプラットフォームであるNovaSeq Xシリーズは、XLEAP-SBSケミストリーを採用し、フローセル密度の向上、前例のないシーケンススループット、そして最終的には低コストを実現しています。ソフトウェアアップデートv1.4では、データ品質と装置の堅牢性がこれまで以上に向上しただけでなく、ユーザビリティと運用効率も大幅に改善されています。これにより、NovaSeq Xシリーズのプラットフォームはさらなる進化を遂げました。

この記事では、ユーザビリティと運用効率の向上についてご説明いたします。         

·      シーケンスランのスケジューリングにおける柔軟性の向上（1番目のフローセルのシーケンス中に、スタガードスタート構成を使用して2番目のフローセルを開始できる機能など）

·      フローセル中に存在するサンプルインデックスの自動検出による、デマルチプレックスエラーと遅延の低減

·      1.5Bフローセルでの2 × 300サイクルシーケンスと5Bフローセルの導入による、新しいフローセルタイプとシーケンス長の増加。

また、データ品質の向上についてもご確認ください。

·      塩基品質の大幅な改善を含む、シーケンスデータ品質の向上

·      シーケンスラン全体にわたって塩基の種類の多様性が低いアプリケーションにおける堅牢性の向上

·      DRAGEN v4.4へのアップグレードを含むNGS二次解析の強化による、バリアントコーリングの精度向上

ユーザビリティの向上

シーケンスランの柔軟なスケジューリング

NovaSeq Xシリーズソフトウェアの旧バージョンでは、デュアルフローセル構成で2つのフローセルを同時に開始できました（図1）。

この同時開始においては、最初の片面のランが終了するまで2回目のランを開始できないとういう制限があったため、運用効率が損なわれていました。ソフトウェアアップデートv1.4では、図2に示すように、第1のフローセルのシーケンス開始後に第2のフローセルを開始できるようになりました。

これにより、ユーザーはリアルタイムのサンプル到着に対応し、サンプルの準備ができ次第シーケンスを開始できるため、プロジェクトを遅滞なく進められるようになりました。フローセルのA側とB側はほぼ独立しているため、装置の稼働時間が最大化され、シーケンス能力が向上するため、NovaSeq X Plusシステムのプラットフォームが提供するスケールを最大限にご活用いただけます。

サンプルインデックスの自動検出により、デマルチプレックスエラーと遅延を低減

シーケンサーに共通する課題は、サンプルデマルチプレックスプロセスにおけるエラーの多発です。こうしたエラーは、サンプルシートの構成がフローセルにロードされたライブラリと一致しない場合に発生します。その影響は大きく、サンプルの再処理が必要になることが多々あり、結果としてターンアラウンドタイムが長くなり、保管コストが増大します。

ソフトウェアアップデートv1.4では、サンプルインデックスの自動検出機能の導入により、この問題を解決しました。この機能により、サンプルシート内の欠損サンプルインデックスが識別され、オプションを使用することで、例えば「2番目の（i5）シーケンシングインデックスの向きが誤っている」といった一般的なミスを修正できます。NovaSeq Xシリーズ、クラウド（BSSH/ICA）、またはローカルサーバーで機能するインデックスの自動検出は、イルミナとイルミナ以外のライブラリー調製キットの両方で機能します。つまり、この機能は最初の試行でBCLをFASTQに正しく変換し、不要なリキューの排除に役立ちます。

インデックスの自動検出には、2つの基本的な操作モードがあります。

·      ブラインド検出

·      ガイド付き検出

図4に示すように、ブラインド検出は入力サンプルシートなしで機能します。

検出されたインデックスは、生成されたサンプルシートの形式でインデックス2の直後に、検出基準と意思決定プロセスを強調するHTMLファイルとJSONファイルとともに利用できます。シーケンス後の出力には、HTML形式の詳細なサンプルごとのFastQC統計レポートが含まれます。オプションで、生成されたサンプルシートに基づいて、シーケンス後に装置上でFastQCファイルを自動的に作成することができます。

ブラインド検出の最も一般的な使用法では、、ユーザーは生成されたサンプルシートをIndex 2の読み取り後の想定結果と照合して不一致（サンプルの欠落など）を特定し、オフライン処理で実行されるBCL Convertランに修正済みサンプルシートを対照的に、ガイド付き検出モードでは、図5に示すように提供します。この強化されたワークフローにより、BCL Convertを1回実行するだけで必要な出力が得られるため、ターンアラウンドタイムの遅延や追加のストレージコストがなくなります。

一方、ガイド付き検出モードでは、図5に示すように入力サンプルシートが必要です:

このほかの点では、ガイドモードはブラインド検出モードと変わりません。検出されたインデックスはインデックス2の直後に利用可能となり、シーケンス後にサンプルごとのFastQCレポートとFASTQCファイルが生成されます。

ガイドモードの利点は、元のサンプルシートの特性（サンプルID、バーコードのミスマッチ率など）を保持しながら、以下のオプション構成を提供することです。

·      修正：インデックス2を逆相補してサンプルを補正、そして/または

·      未確定データからリードカウントが多いインデックスを抽出してサンプルを追加

逆相補プロセスは単純です。元のサンプルシートのデマルチプレックスサンプルの割合が5%未満の場合、サンプルシートのインデックス2は逆相補されます。逆相補したサンプルシートでデマルチプレックス率が80%を超える場合は、逆相補したサンプルシートが受け入れられます。ソフトウェアアップデートv1.4では、逆相補操作はフローセル単位で行われます。今後のアップデートでは、逆相補プロセスはレーン単位で行われる予定です。

ガイドモードの最も一般的なユースケースには、FASTQCファイルの生成が含まれます。

さらに、ガイドモードは、サンプルシートの特定のパラメーター化（例えば、バーコードミスマッチ許容差）を維持しながら、ブラインド検出をエミュレートするように構成できます。

図6は、自動検出機能の精度を示しています。

検出失敗率と偽検出率の統計を生成します。意図しない追加サンプルをユーザーが簡単に廃棄できることから、アルゴリズムは検出失敗率を低減するように調整されています。一般的に、自動検出は、イルミナが生成した複数のライブラリー調製およびアプリケーションで得られたシーケンスデータに対し良好に機能します。また、アルゴリズムはユーザーフィードバックに基づく今後のリリースで改良される予定です。検出処理はインデックス2の後に実行されるため、処理時間は比較的短くなります。通常、シーケンス後の統計は洗浄サイクル中に完了し、FASTQC生成は次回のランのクラスター生成までに完了するため、図1および図2に示すように、24時間365日の連続シーケンスが可能です。

重要なのは、ソフトウェアがライブラリープールの内容をを自動的に判断することへの懸念は、基本的に不要であるということです。 自動検出処理は、常にユーザーの管理下にあり、候補インデックスの採用に必要な最小リード数などのパラメーターも、必要に応じて特定のアプリケーションに合わせてカスタマイズ可能でます。つまり、インデックスの自動検出はユーザーに代わって判断を下すものではなく、意思決定を支援する情報を提供する仕組みです。また、自動検出によって、意図しない追加サンプルが特定された場合でも、それらは用意に破棄できます。

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新しいフローセルタイプとシーケンス長により、最適化されたバッチ処理と新しいアプリケーションを実現

ソフトウェアアップデートv1.4では、運用効率を向上させるNovaSeq Xシリーズの新しいミッドレンジスループットとして、5Bフローセルが導入されました。5Bフローセルは、100、200、300サイクルのキットで使用できます。これらのキットは、Illumina Protein Prepのパイロット研究、または一般的なサンプル到着間隔に合わせたより実用的なバッチサイズを求めるユーザーに最適です。

さらに、ソフトウェアアップデートv1.4では、1.5B 600サイクルフローセルの導入により、シーケンスオプションが拡張されました。この新しい構成は、ショットガンメタゲノミクス、免疫レパートリープロファイリング、アンプリコンシーケンスなどのアプリケーションのためのハイスループットティアを解放し、1回のランでより深いカバレッジと長いリード長を実現します。

ユーザーがインストールできるソフトウェア

NovaSeq Xシリーズの以前のソフトウェアアップデートでは、Illuminaのフィールドサービスエンジニアが装置を最新のソフトウェアリビジョンに更新する必要がありました。ソフトウェアアップデートv1.4のリリースにより、Illumina Software Update Manager（ISUM）を使用して、イルミナの支援なしにコンボのソフトウェアバージョンのアップグレードプロセスを実行できます。ISUMは、インストール作業を簡素化するだけでなく、新しいソフトウェアリリースが提供されるたびに、最新のシーケンサー機能強化を迅速に導入できるようにします。

シーケンスデータ品質の向上

塩基品質の向上

NovaSeq Xシリーズのソフトウェアアップデートを重ねるごとに、イルミナはデータ品質を継続的に向上する取り組みを着実に実証しています。これらの改善は、Q30を超える塩基の割合の増加に反映されており、それに対応してバリアントコールの精度も向上しています。データ品質の向上は、シーケンスプロセスを制御する一連のイベントであるシーケンスレシピの最適化、DNAライブラリー断片がフローセルに付着して増幅されるプロセスであるクラスター化の強化、そしてシーケンサーからベースコールを抽出するために使用されるシグナル処理アルゴリズムである一次解析の改善によって促進されます。

ソフトウェアアップデートv1.4では、シーケンスレシピ内の熱ステップと流体ステップの速度とドウェルタイムを微調整することで、さらなる改善を達成しました。クラスター化ステップは、よりゲノム的に純粋で堅牢なクラスターの成長を促進するように最適化されました。これらの改善により、シグナル対ノイズ比が向上し、より高いクオリティースコアが得られます。さらに、一次解析におけるシグナル処理の強化により、特に塩基多様性が変動する困難な条件下で、より堅牢な性能がもたらされました。

これらの変更の結果、一次解析データの品質が明らかに改善されています。図7は、最高品質ビンの平均クオリティースコアが、ソフトウェアアップデートv1.3のQ40からQ41に増加したことを示しています。さらに、ほとんどの塩基は平均Q41を上回っています。この高いクオリティースコアへの移行は、10Bおよび25Bフローセルで観察されます。

Q41への移行に加えて、Q30を超える塩基の割合もソフトウェアアップデートv1.4で増加しました。図8は、Phi XおよびTruSeq PCR-Freeライブラリの改善を示しています。

多様性の低い条件における強化：

一部のシーケンスライブラリーでは、4つの塩基タイプはそれぞれ、特定のサイクルでシーケンスされたクラスターのプールに十分に存在していません。低多様性の条件は、4つの塩基型のうちの1つ以上がデータで著しく過少である場合に発生します。多様性の低い条件下で高いデータ品質とベースコール精度を維持することは、特に塩基の多様性がサイクルごとに変化する場合に、リアルタイムベースコールにとって困難です。

低多様性のアプリケーションにおける堅牢性を向上させるため、各サイクルで最小限の塩基多様性を確保する目的でPhi X添加が推奨されます。ソフトウェアアップデートv1.3の機能強化により、Phi X添加が15%から5%に減少し、使用可能なデータが10%増加しました。ソフトウェアアップデートv1.4では、特に塩基の多様性がサイクルごとに変化するアプリケーションにおいて、低多様性条件下での性能をさらに向上させる追加の機能強化が加えられています。

図9Aは、v1.3と比較してソフトウェアアップデートv1.4でのパフォーマンスの向上を示しており、Q30を超える塩基の割合が高く、塩基品質のマイナスの落ち込みが少ないことを示しています。図9Bは、塩基多様性が高多様性から低多様性に移行し、その後高多様性に戻るアプリケーションを示しています。これらの条件下では、ソフトウェアアップデートv1.4はQ30メトリクスで測定した高いデータ品質を一貫して維持します。これらの改善は、より典型的な多様性の高いユースケースでパフォーマンスに影響を与えることなく達成されました。

強化された二次解析

精度向上

一次解析データ品質の向上とDRAGEN v4.4へのアップグレードにより、二次解析性能が向上します。HG002サンプルは、10Bおよび25Bフローセル上のTruSeq PCR-Free 450ライブラリーを使用して処理されました。バリアントコーリングの結果をT2T真理値セットに対して評価し、結果は図10に示します。ソフトウェアアップデートv1.3と比較して、ソフトウェアアップデートv1.4では偽陽性（FP）率と偽陰性（FN）率の両方が大幅に低下しています。

DRAGEN v4.4へのアップグレード：

ソフトウェアアップデートv1.4には、DRAGEN v4.4へのアップデートによって可能になった二次解析に対する性能強化が含まれます。シーケンサーでは、BCL Convert、DRAGEN Germline（全ゲノムシーケンス用）、DRAGEN Somatic（腫瘍のみ、全ゲノムシーケンス用）、DRAGEN RNA、DRAGEN Enrichment（生殖細胞系列および体細胞腫瘍のみモード）、DRAGEN Methylationなど、以前に利用可能なすべてのパイプラインがアップグレードされています。

BCL Convertは、自動検出に加えて、データセクションのカスタムフィールドをサポートするようになり、サンプルのトレーサビリティと追跡が向上しました。さらに、DRAGEN Somaticパイプラインは現在、造血器腫瘍と固形腫瘍の両方のオプションをサポートしています。以前のリリースと同様に、複数のDRAGENバージョンをシングルフローセルで使用できます。また、以前のDRAGENバージョンは最新のソフトウェアアップデートv1.4で実行されます。

クラウドベースのパイプラインには、シーケンサーで可能なものが含まれ、DRAGEN Protein QuantificationやDRAGEN Single-Cell RNAなどの追加の提供もあります。詳細については、NovaSeq Xシリーズソフトウェアインストーラーおよびリリースノートを参照してください。

近日発売

今後のリリースでは、次の機能の追加が予定されています。

ファイルベースのLIMS イルミナは、初めて消耗品をローディングした後のランの自動化を導入することで、オペレーターのミスを最小限に抑え、クリニカル分野やバイオ医薬品分野のお客様向けにトレーサビリティを強化します。

自動検出の強化
イルミナは、ユーザーフィードバックに基づいて自動検出機能を拡張し、レーンごとのインデックス補正、種検出、サンプルごとのカバレッジメトリクスを追加します。

データ品質の向上
イルミナはQ70クオリティスコアテクノロジーを導入し、比類のない精度で新世代の腫瘍学アプリケーションを可能にします。

 

出力の増加
イルミナは、NovaSeq Xシリーズのアウトプットを250億から350億（40%増加）に、一方100億の構成を140億に拡大させるため、同じ装置でより大規模かつ複雑な研究が可能になります。

 

速度の向上
イルミナはターンアラウンドタイムを短縮し、20～22時間で140億のアウトプットを実現し、全ゲノムシーケンス（WGS）ワークフローのスピードを平均30%向上させます。

結論

ソフトウェアアップデートv1.4はNovaSeq Xシリーズの大きな前進を示し、運用の柔軟性、使いやすさ、データ品質という3つの側面にわたってプラットフォームを前進させます。フローセルのスタガードスタートの導入により、ユーザーは、フローセルの片側が空いている場合、サンプルの準備が整い次第、オンデマンドで2回目のランを開始できるようになりました。これにより、フローセルのスケジューリングを最適化できます。新しい5Bフローセルは、運用効率を向上させる柔軟なミッドレンジスループットオプションを提供し、1.5Bフローセルでの600サイクルランは幅広いアプリケーションを可能にします。

今後のソフトウェアバージョンへのアップグレードは、Illumina Software Update Managerを使用して、イルミナの支援なしで実行できます。これにより、新しいソフトウェアがリリースがリリースされるたびに、最新のシーケンサーの機能強化を迅速に導入できるようになりました。これらの進歩は共に、かつてない柔軟性をもたらし、運用効率の大幅な向上を可能にします。

さらに、ソフトウェアアップデートv1.4は、初回発売から長期間が経過した後も、出荷済みプラットフォームのデータ品質を改善するというイルミナのコミットメントを強化しています。このリリースでは、妥協のないデータ品質を維持しながら、フローセルあたりのデータ出力が大幅に増加しました。特に、Q30を超える塩基の割合は、以前のソフトウェアバージョンと比較して高くなっています。これらの品質改善は二次解析に直接影響し、SNPとインデルの両方について、精度とリコールの測定可能な向上をもたらします。

ソフトウェアアップデートv1.4は、NovaSeq Xシリーズのイノベーションロードマップにおける初期のマイルストーンであり、NovaSeq Xイノベーションロードマップに概説されている出力、スピード、および精度の継続的な進歩のための基盤を確立しながら、柔軟性、効率性、およびデータ品質の向上を実現します。