Abstract
- 急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄腫、慢性リンパ性白血病などのがんに関する研究は、個別化医療の大幅な進展に貢献しています。
- 従来の検査アプローチとしては、核型分析、FISH（蛍光in situハイブリダイゼーション）、染色体マイクロアレイ、遺伝子パネルなどがあります。
- 全ゲノムシーケンスでは、これらの疾患に関連するすべての重要な異常やバリアントタイプを、単一のワークフローで検出することができます。
はじめに
1973年、シカゴ大学のJanet Rowley氏は、慢性骨髄性白血病（CML）の細胞遺伝学的基礎を解明しました。彼女が調査したほぼすべての細胞で、染色体9と染色体22の間に転座があることを発見したのです。この発見は、1959年にPeter Nowell氏とDavid Hungerford氏がCML患者のフィラデルフィア染色体を同定した研究をもとにしています。これは、がんと遺伝子の間に初めて直接的な関連性が示された出来事でした。1990年代には、この相互転座イベントがBCR（B細胞受容体）とABL1（ABL1キナーゼドメイン）からなる融合遺伝子、BCR-ABL1を生成することが分子的に解明されました。BCR-ABL1融合遺伝子の発見は、標的治療への道を切り開きました。イマチニブ（商品名：Gleevec）は、CMLにおけるBCR-ABL1タンパク質をターゲットにするために開発された最初のチロシンキナーゼ阻害剤でした。イマチニブは2001年に米国食品医薬品局（FDA）により承認され、がん治療に新たな時代をもたらしました。CML患者において、5年生存率89%という前例のない成功を収めています。
CMLの症例の大半、95%以上は、典型的なt(9;22) 転座を特徴としています。急性骨髄性白血病（AML）や骨髄異形成症候群（MDS）などの骨髄系悪性腫瘍、および多発性骨髄腫（MM）や慢性リンパ性白血病（CLL）などのリンパ系悪性腫瘍は、多種多様なバリアントによる遺伝的不均一性を特徴としています。例えば、AMLでは、t(8;21)、inv(16)、t(15;17)などの再発性染色体転座や、FLT3、NPM1、CEBPA、IDH1/2、DNMT3Aといった遺伝子の変異が重要な遺伝的所見として挙げられます。これらの変異は、特定のAMLサブタイプを定義し、それぞれ異なる予後に関する示唆を与えます。これらの遺伝子変異は、疾患の挙動、治療への反応、リスク層別化に影響を与えます。こうした遺伝的所見の多様性は、他の骨髄系およびリンパ系の血液がんにも共通しています。
白血病管理の一般的なワークフローは、血球数検査や骨髄生検による初期診断、分類、ゲノムツールを用いたリスク層別化、そして化学療法、幹細胞移植、維持療法による治療などで構成されます。適切な分類とリスク層別化は、患者管理において極めて重要であり、幹細胞移植やその他の介入に関する主要な臨床判断に欠かすことができません。
血液がんにおける現在の遺伝子検査および分子検査は、マルチモーダルアプローチを採用しており、これらの検査結果は世界保健機関（WHO）やその他の臨床ガイドラインに基づいて疾患の分類とリスク層別化に使用されています。従来の細胞遺伝学（核型分析）は、大規模な染色体異常の検出に使用される一方、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）は、特定の再構成や潜在的な転座を同定するのに役立ちます。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および逆転写PCRは、FLT3やNPM1といった特定の遺伝子変異や融合遺伝子転写産物を検出し、診断や微小残存病変（MRD）のモニタリングを支援します。ターゲットパネルを含む次世代シーケンサーは、リスク層別化のための包括的な変異プロファイリングを実現します。染色体アレイや光学的ゲノムマッピング法は、特定の状況で使用されます。
全ゲノムシーケンス（WGS）は、染色体の変化、構造的変異、細胞遺伝学やFISHなどの従来の方法では見逃しかねない隠れた変異など、関連するすべての遺伝子異常を検出する包括的なゲノムプロファイリングを提供することで、効率的な代替手段であることが実証されています。これにより、分類およびリスク層別化の精度が向上します。AML/MDSに関する1つの研究では、WGSを現在の標準的な検査手法と比較した結果、患者の約25%で追加の診断所見が得られ、約17%で異なるリスク層別化が適用されることが判明しました。1さらに、WGSは、血漿ベースの微小残存病変（MRD）を検出するためのターゲット探索など、新たな分野を可能にし、経時的な検査において骨髄穿刺の使用からの移行を促進します。WGSは、複数の検査を統一されたワークフローのもとで単一のアッセイに統合することで、診断プロセスを効率化し、約5日間という短いターンアラウンドタイムを実現します。従来、WGSは高価な検査と考えられていましたが、シーケンスコストの低下により、より経済的に実施できるようになっています。さらに、この手法は急性骨髄性白血病（AML）および骨髄異形成症候群（MDS）管理に関する米国がんネットワーク の診療ガイドラインに盛り込まれており、メディケアによる保険適用の対象となっています。
仕組み
イルミナの既存製品およびワークフローを使用することで、血液悪性腫瘍を有する被験者から得られた検体から、包括的で高品質なゲノムデータを生成できます。研究の目的に応じて、末梢血や骨髄穿刺検体から抽出されたDNAがインプットとして適しています。体細胞バリアントを検出するには、重要なイベントが細胞の一部にしか存在しない可能性があるため、より深い平均カバレッジが推奨されます。通常、高いシーケンス深度を達成するには、比較的少数のライブラリーを用いてプーリングが行われます。このため、アダプターシーケンスの類似性によるデータ損失を避けるために、サンプルインデックスの選択には注意が必要です。詳細については、当社のインデックスアダプタープーリングガイドをご覧いただくか、最寄りのイルミナサポートチームにお問い合わせください。
| カテゴリー | 名前 | 説明 |
|---|---|---|
| ライブラリー調製 | Illumina DNA PCR-Free Prep Illumina DNA Prep |
標準WGSライブラリー調製 |
| シーケンサーとフローセル | NovaSeq 6000（S2およびS4対応） NovaSeq XおよびNovaSeq X Plus（10Bおよび25B対応） |
大容量ゲノムシーケンス |
| バイオインフォマティクス | DRAGEN v4.3 Somatic （Heme Recipe搭載） |
血液系全ゲノムシーケンス（WGS）研究向けに最適化されたマッピングおよびバリアントコーリング |
| 解釈とレポート作成 | Illumina Connected Insights | 腫瘍学アプリケーション用の三次解析プラットフォーム |
表1：血液悪性腫瘍におけるWGS研究を支えるイルミナ製品の一覧
全体像
血液悪性腫瘍の包括的なゲノム解析には、小規模バリアント（1塩基変異や50塩基対未満の挿入・欠失）、コピー数異常（CNA）、転座などの構造多型（SV）、およびヘテロ接合性欠失（LoH）の計算を含む複数のバリアントタイプの評価が必要です。DRAGEN Somatic WGS Heme Tumor Onlyレシピ は、バリアントコーリング、カバレッジ深度解析、ブレークエンド検出、その他のアルゴリズムを組み合わせることで、血液悪性腫瘍に関連するバリアントを精確かつ包括的に解析する結果を導き出します。
| 解析感度（検出下限） | |
|---|---|
| 平均カバレッジ | 140× |
| 小規模バリアント（VAF） | 0.05 |
| 構造多型LoD（VAF） | 0.07 |
| 0.5 Mb～5 MbのCNA欠失（倍数変化） | 0.09 |
| 0.5 Mb～5 MbのCNA重複（倍数変化） | 1.09 |
| 5 Mb～10 MbのCNA重複（倍数変化） | 1.07 |
| 0.5 Mb～5 MbのLoH（腫瘍純度） | 0.17 |
| 5 Mb～10 MbのLoH（腫瘍純度） | 0.15 |
表2：140倍で確立された小規模バリアント、構造多型、CNA、LoHの解析感度（検出下限）
図3：血液悪性腫瘍患者の臨床検体におけるWGSによるバリアントコーリング性能 —DRAGENは、23例の臨床検体で73件の小規模バリアント（31遺伝子）、10件のSV（7遺伝子）、および29件のCNAのうち28件を精確に検出しました。
研究者と協力し、血液悪性腫瘍患者の23例の臨床検体について、PCRフリーのWGSを平均カバレッジ約220×で実施しました（図3）。当社のチームは、このコホート全体において、臨床的に重要な小規模バリアント（n=73、そのうち4件はFLT3-ITDを含む）、構造多型、96%以上のCNAを精確に検出しました。具体的には、約45 Mbおよび56 Mbの2件の逆位、8件の転座、4.5 Mbから100 Mbの範囲にわたる22件のコピー数異常（CNA）、および7件の全染色体イベントが評価されました。
WGSの性能をさらに評価するために、AML患者からの追加の末梢血または骨髄穿刺検体30例について、WGSによるバリアントコーリングをTruSight Oncology 500の結果と比較しました。本研究の結果は表3にまとめられており、関連するバリアントタイプに対して高い精度が示されています。
| AML検体の解析性能 | |
|---|---|
| AML検体数 | 53 |
| 平均カバレッジ | ~200× |
| 小規模バリアント（SNV/Indel）の精度 | >99% |
| 構造多型/コピー数異常の精度 | >95% |
| 分析特異度 | > 99.9% |
表3：約200×のカバレッジで実施した研究コホートにおけるWGSアッセイ性能
ゲノムの時代
Blood誌に発表された論文によれば、「骨髄性腫瘍の患者では、全ゲノムシーケンスは従来の細胞遺伝学的アプローチとシーケンスアプローチの両方に代わる可能性があり、迅速かつ精確な包括的ゲノムプロファイリングを実現する」とされています。 2
イルミナの血液悪性腫瘍のための包括的な全ゲノムシーケンスとインフォマティクスソリューションにより、単一のプラットフォームで統一されたワークフローを実現します。これにより、従来の方法と比較して、ラボの効率と臨床的有効性が向上します。この新しいテクノロジープラットフォームを用いることで、大規模な染色体再編成から1塩基変異に至るまで、あらゆるレベルの詳細を精確に評価できます。追加サポートが必要な場合は、お近くのアカウントマネージャーまたは営業担当者にお問い合わせください。
リソース
illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/illumina-dna-prep.html
illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/dna-pcr-free-prep.html
help.dragen.illumina.com/product-guides/dragen-v4.3/dragen-recipes/somatic-wgs-heme-to
学術用途向けの詳細情報またはDRAGEN試用版ライセンスについては、dragen-info@illumina.comまでお問い合わせください。
注釈
- Duncavage EJ, Schroeder MC, O’Laughlin M, et al. Genome Sequencing as an Alternative to Cytogenetic Analysis in Myeloid Cancers. N Engl J Med. 2021;384(10):924-935. doi:10.1056/NEJMoa2024534
- Duncavage EJ, Bagg A, Hasserjian RP, et al. Genomic profiling for clinical decision making in myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2022;140(21):2228-2247. doi:10.1182/blood.2022015853