NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3はデータ品質と顧客による使いやすさを向上

NovaSeq Xシリーズの出荷開始により、イルミナの次世代ハイスループットプラットフォームでXLEAP-SBSケミストリーが利用可能になりました。さらに、25Bフローセルを使用することで、NovaSeq Xシリーズのソフトウェアアップデート1.2は、デュアルフローセルシーケンスランで最大16テラ塩基を生成できるようになりました。ソフトウェアアップデート1.3では、データ品質と装置のロバスト性が大幅に改善されており、NovaSeq Xシリーズの進化を続けています。

この記事では、以下の点に重点を置いています。   

• フローセルの収量、サンプルのデマルチプレックス法、多様性の低い条件下での精度の大幅な改善など、シーケンスデータの品質の向上
• DRAGEN v4.3へのアップグレード、BCL Convertランタイムの短縮、より柔軟な構成オプションなど、NGS二次解析の強化
• 多様性の低いアプリケーションにおけるPhiX添加要件の軽減、RNAアプリケーション用の特別なレシピの排除、LIMSとのターンキー統合によるユーザビリティの向上

シーケンスデータ品質の向上

より高い収量：

ソフトウェアアップデート1.3では、シーケンスプロセスを促進する一連のイベントであるシーケンスレシピを最適化することで、フローセルナノウェルから発せられるシグナルを強化し、より高い収率を達成しました。速度や滞留時間の調整など、サーマルステップとフルイディクスステップの変更によって改善を達成しました。クラスター化プロトコールの主要なステップは、より明るく、よりロバストなクラスターを成長させるために最適化されました。ポストランウォッシュは、ラン間のフルイディクスシステムの洗浄をより効率的に行うために改善されました。これらの変更により、Signal to Noise比（SN比）が高くなり、結果的に収量とクオリティスコアが向上しました。

レシピの改善に加えて、NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3では、イルミナがより高いデータ品質を追求するにあたって不可欠となる画像処理アルゴリズムも改善されました。ハイスループットフローセルでは、パターン化フローセルのウェル位置へのイメージピクセルのアライメントは特に困難です。これは、ウェル位置の推定がジッターや歪みの影響を受ける可能性があるためです。ジッターは通常、意図しないカメラの動き、装置の振動、または画像の再配置によって発生し、歪みはカメラレンズの形状によって誘発されます。ソフトウェアアップデート1.3では、フローセル上の空間的エラーを排除することで、ピクセルとウェルの位置の同期において優れた性能を示す新しいアプローチが実装されています。改善点を図1に示します。円はウェル内のクラスターの実際の位置を示し、Xマークは推定位置を示します。ヒートマップは、フローセルのセクション上のx方向（水平方向）の空間エラーを示し、ソフトウェア1.3アルゴリズムが適用された後に有意な減少が観察されます。

レシピの改良は、ジッターや歪みの補正とともに、システムの収量向上に大きく貢献します。これらの改善点を図2と図3に示しています。図2と図3では、TruSeq DNA PCR-Free（TSPF）およびIllumina DNA PCR-Free（IDPF）のライブラリーを用いて、NovaSeq Xソフトウェア1.2をソフトウェアアップデート1.3と比較しています。システム上のすべてのフローセルタイプについて、クラスターパスフィルター（PF） の分布は劇的に右にシフトしています。さらに、ラン間のばらつきが小さくなったことで、分布が狭くなっています。その結果、フローセルの収量が増加しています。

このパスフィルター率の改善は、塩基の品質を犠牲にすることなく達成されました。実際、すべてのサイクルで平均すると、Q30を超える塩基の割合もNovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3で改善しています。3種類のNovaSeq XフローセルタイプすべてにおけるIDPFおよびTSPFライブラリーの改善を図4に示します。

サンプルデマルチプレックス法の改善：

使用可能な収量は、フローセルパスフィルター上のクラスター数だけでなく、適切なサンプルにデマルチプレックスされたリード数にも依存します。

サンプルのデマルチプレックス法は、インデックスサイクル中のベースコーリング精度に依存しており、これはランで使用されるレーンあたりのサンプル数であるプレキシティによって異なる場合があります。インデックスサイクル中のミスコールが測定され、ランのミスマッチ率が0、1、2塩基で報告されます。NovaSeq Xソフトウェア1.2は、デマルチプレックス効率が比較的低い（ミスマッチ率が高い）ため、一部のサンプル、特に低プレックスのラン（レーンあたり4～10サンプル）ではスループットが失われます。ソフトウェア1.2では、一部のインデックスは予想強度のサイクル依存的な低下を示し、そのインデックスのミスコール率が高くなるため、全体的なデマルチプレックス効率が低下します。

NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3では、この問題を軽減するための改善が行われました。これで、強度の予想レベルが適応的に学習され、インデックスサイクル中に情報がベースコーリングアルゴリズムに伝達されます。結果として得られる改善を図5Aに示します。NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3により、特に低プレックスの条件下で、1つのミスマッチ率の顕著な減少を示しています。さらに、図5Bは、インデックス依存性ミスマッチ率がソフトウェア1.3で大幅に改善されたことを示しています。

パスフィルターレートの改善とデマルチプレックス効率の向上が組み合わさり、使用可能な収量の増加に直接つながっています。図6はNovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3によって提供される使用可能な収量の改善を示しています。

多様性の低い条件における強化：

一部のシーケンスライブラリーでは、4つの塩基タイプはそれぞれ、特定のサイクルでシーケンスされたクラスターのプールに十分に存在していません。多様性が低いランとは、データ集団で4つの塩基のうち1つ以上が著しく少ないランのことです。多様性が低い条件下で高いデータ品質とベースコーリング精度を維持することは、リアルタイムのベースコーリングでは困難です。多様性の低いアプリケーションをご利用のお客様は、NovaSeq Xソフトウェア1.2では、多様性の高いライブラリーであるPhiXを実際のシーケンスサンプルとともに十分なレベルで添加することをお勧めします。十分なレベルの添加PhiX（15%など）を使用すると、ライブラリーの多様性の低い性質は下流のアルゴリズムからマスクされ、多様性の高いライブラリーと同等のデータ品質を維持します。しかし、この添加要件には、PhiXライブラリーが占有していたスループット（この例では15%）を失うコストが伴います。

NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3は、多様性の低い設定でベースコールの性能を向上させることで、PhiXの添加率（5%）の要件を大幅に低減します。（多様性のレベルがサイクルごとに大きく異なるライブラリーについては、PhiXの添加率15%という以前のガイドラインを引き続き適用してください。） 性能の向上を図7Aおよび7Bに示します。これは、PhiXの添加率が低くても、NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3における低多様性ライブラリーで高いレベルのパスフィルターの割合とQ30を超えるデータ品質を維持できることを示しています。

強化された二次解析

DRAGEN v4.3へのアップグレード：

DRAGEN v4.3にアップグレードすると、マルチゲノムマッパーとパンゲノムリファレンスの更新により、精度が大幅に向上します。現在、パンゲノムリファレンスは、26の異なる祖先をカバーする128のサンプル集団にまで拡大しています。マルチゲノムマッパーの進歩により、新しいリファレンスをより有効に利用でき、DRAGEN v4.1と比較して、集団全体でSNPの偽陽性（FP）と偽陰性（FN）が平均で49.0%、IndelのFPとFNが平均で19.6%減少しました。これらの改善は図8に示されており、HG001～HG007サンプルセット全体で35％～50％の減少を示しています。ヨーロッパの祖先サンプルのエラーも、DRAGEN v4.1のパンゲノムリファレンスと比較して40.2％減少し、ヨーロッパ以外のサンプルでは47.0％減少しました。

BCL Convertの迅速化：

データ品質の向上に加えて、装置内バージョンまたはBaseSpace Sequence Hubアプリケーションのいずれかを使用した場合、BCL Convertが迅速化されました。図9Aは、新しくリリースされた装置内のDRAGEN v4.3.13のランタイムがDRAGEN v4.1.23と比較して約5分の1に短縮されたことを示しています。ランタイムの短縮は、装置内の迅速化とより柔軟な構成オプションの組み合わせによって実現しています。例えば、以前に提供されたORA設定に加えて、レーン分割なし（NLS）やFASTQCメトリクス生成などです。25Bフローセルの構成オプションおよび対応するランタイムを図9Bに示します。

より柔軟な構成：

ランタイムの短縮に加えて、DRAGEN BCL Convert v4.3.13は追加の構成オプション（サンプルプロジェクトやレーン分割なしなど）にも対応できるようになりました。さらに、フローセル構成の柔軟性がより高まりました。DRAGEN v4.3.13は、シングルフローセルで最大12のワークフロー / ゲノムペアをサポートし、ワークフロー / ゲノムペアごとに最大32の固有の構成をサポートします。柔軟性の向上を表1に要約します。

DRAGENのバージョン	ワークフロー / ゲノムペア	ペアあたりの構成数
v4.1.23	3 + BCL Convert	8
v4.3.13	12 + BCL Convert	32

表1：DRAGEN v4.1.23とDRAGEN v4.3.13の構成柔軟性の比較

クラウドへのBAM/CRAM転送：

NovaSeq Xシステムのユーザーの多くは、DRAGENを使用して装置上でマッピングとアライメントを直接実行し、特殊な後処理（カスタムバリアントコーリングなど）をオフラインで実行します。このアプローチにより、マッピングとアライメントが、次のシーケンスランが始まる前に完了するため、ユーザーはDRAGENの高速な処理時間を活用することができます。ソフトウェアアップデート1.3によって、こうしたユーザーはFASTQ/ORAおよびBAM/CRAMをBaseSpace Sequence Hubに直接送信できるようになりました。

NovaSeq XのDRAGEN v4.3.13の詳細については、このリンクのリリースノートを参照してください。

ユーザビリティの向上

特別なレシピなしでのRNA処理：

一部のライブラリー調製法にアダプターを追加すると、シーケンスランの最初のサイクル内で塩基の多様性が低くなります（T塩基のみなど）。これに対しては従来、「ダークサイクル」のカスタムレシピ、つまりイメージングが実行されないサイクルを使用して対処されてきました。ただし、これらのカスタムレシピは、同じフローセルで、最初のサイクルでイメージングを必要とするその他のライブラリーと互換性がない場合があります。

NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3における改善により、これらのユニークなライブラリーのシーケンスにカスタムダークサイクルレシピが不要になりました。その結果、これらのライブラリーを同じフローセル上でマルチプレックス化することで、マルチオミクスのユースケースをより柔軟に実現することができます。改善点を表2に示します。これは、ダークサイクルレシピなしのソフトウェア1.2（強制失敗状態）、カスタムダークサイクルレシピありのソフトウェア1.2、初期設定（ダークサイクルなし）レシピありのNovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3の3つの条件下でのRNAライブラリーのシーケンスの主要メトリクスを比較したものです。予測通り、強制失敗状態では、結果として得られるシーケンス品質は低く、高いエラー率とクラスターパスフィルター率（%PF）は低くなっています。ソフトウェア1.3でダークサイクルレシピを使用しない場合、シーケンス品質が向上し、ソフトウェア1.3レシピの%PF改善により、ダークサイクルレシピありのソフトウェア1.2に匹敵するエラー率とパスフィルターメトリクスが実現するというさらなるメリットが得られます。ダークサイクルレシピの使用を継続したい方のために、ソフトウェア1.3では％PFレシピの改善も組み込んだカスタムダークサイクルレシピも提供します。

また、図10に示すように、二次解析の結果は、ダークサイクルレシピなしのNovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3と、ダークサイクルレシピありのソフトウェア1.2との間で良好な一貫性が示されています。遺伝子発現の相関解析、100万個あたりの転写産物（TPM）では、1.5Bと10Bの両方のフローセルでR2 = 0.999の高い一致率が確認されました。ソフトウェア1.3では、BCL Convertのオーバーライドサイクル（N1Y74I10I10N1Y74）を使用して最初のサイクルT塩基をトリミングする必要があります。

Illumina Clarity LIMSの統合：

Illumina Run Managerは、Clarity LIMSとNovaSeq Xシステム間のターンキー統合を、完全にオンプレミスのお客様に提供します。

主な特徴には以下があります：

• プーリング、希釈、変性などに関するステップバイステップのガイダンスを備えた、すぐに使えるNovaSeq Xワークフロー
• シーケンスランと解析計画
• シーケンスランのステータスとメトリクスの追跡
• サンプルシートのバリデーション
• 解析ランのステータスとメトリクスの追跡

APIを介したサードパーティLIMSのサポート：

最新のアップデートにより、NovaSeq Xユーザーは、ロバストなAPI機能を通じて、サードパーティ製または自家製LIMSをこれまで以上に簡単に統合できるようになりました。これらの機能強化により、LIMSワークフローがいかに簡素化され、合理化されるかをご紹介します。

• ベアラートークンによる安全な認証：ユーザーは、認証クライアントを作成し、認証情報を安全に生成し、それらを使用してベアラートークンを取得できるようになりました。このトークンにより、イルミナランマネージャー（IRM）エンドポイントとのシームレスで安全なやり取りが可能になります。
• Webhookによるリアルタイム通知：イベントトリガー通知で最新の情報を把握できます。ユーザーは、IRMで特定のイベントが発生するたびに、外部ウェブサーバーに更新を自動的に配信するようにWebhookを設定できるため、タイムリーで効率的なモニタリングが保証されます。
• ラン管理の自動化：計画されたランをLIMSから直接作成できるAPIを活用して、操作を簡素化します。これらのランは装置上で選択して開始できるため、手動操作を減らし、時間を節約できます。

よりシンプルなディスク容量管理：

NovaSeq Xシステムはハイスループットのため、大量のデータを管理するという課題に直面します。NovaSeq Xソフトウェアアップデート1.3では、2つの新しいデータ管理機能を提供することでデータ管理を簡素化します。第一に、ユーザーは、データが装置外の保管場所に正常に転送されると、装置から二次解析データを自動的に削除するようにシステムで設定することができます。第二に、一次解析データを装置内に保存する十分なスペースがある場合、ユーザーは2回目のシーケンスランを開始できます。第二の機能では、ユーザーはシーケンスランの終了前にいつでも装置から前のランのデータを削除できます。二次解析が開始され、容量が不十分な場合、二次解析ランは自動的にキャンセルされます。

今後の展開

段階的な処理の開始： 最初のフローセルがまだ進行中の間に、2番目のフローセルでランを開始できるようになります。

ファイルベースのLIMS統合：初めて消耗品をローディングした後、ランの自動化を提供することで、オペレーターのミスを最小限に抑え、クリニカル分野やバイオ医薬品分野のお客様向けにトレーサビリティを強化します。

1.5B 600 Cycleキット：ショットガンメタゲノミクス、免疫レパートリープロファイリング、アンプリコンシーケンスなどのアプリケーションのためのハイスループットティアを解放し、1回のランでより深いカバレッジと長いリード長を実現します。

データ品質の向上： データ品質をさらに向上させ、お客様のワークフローの精度と信頼性を高めます。

結論

NovaSeq Xシリーズのソフトウェアアップデート1.3により、データ品質と装置のユーザビリティの両方を大幅に改善できます。高いデータ品質の面では、シーケンスレシピの変更、画像処理アルゴリズム、および低多様性の強化によって、サンプルあたりの収量の向上が実現しています。さらに、二次解析はDRAGEN v4.3へのアップグレードで強化され、BCL Convertランタイムはより高速に、構成オプションはより柔軟になっています。最後に、ユーザビリティの面では低多様性アプリケーションに対するPhiX添加要件の低減、RNAアプリケーション用の特別なレシピの排除、およびLIMSとのターンキー統合といった改善を実現しました。