Perturb-Seqは、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR、クラスター化された規則的インタースペース短パリンドロームリピート）による摂動の精度と、シングルセルRNAシーケンス（scRNA-Seq）を組み合わせたハイスループット手法です。この複合的アプローチは、単一細胞解像度での遺伝的摂動のトランスクリプトーム全体の影響を研究し、遺伝子制御ネットワーク（GRN）と細胞応答を調査し、ヒトの健康と疾患に関する洞察を提供するために使用されます。1
これまで、scRNA-Seqのコストとワークフローの制約により、Perturb-Seqを使用する研究の規模とスループットには制約がありました。こうしたボトルネックは、遺伝的変異とヒト形質の間のメカニズム的関連性を提供するGRNのマッピングを求める研究では問題となります。シングルセルトランスクリプトミクスは転写状態の高解像度リードアウトを提供しますが、観察データを使用して因果的な制御関係を推測することは困難です。2,3
ゲノム規模のPerturb-Seqスクリーンは、標的遺伝的摂動を導入することで、これらの制約に対処するのに役立ちます。これにより、研究者は遺伝子機能を特定し、因果的な制御関係を確立し、機能ゲノミクスの洞察を得ることができます。イルミナは、スループットとワークフローにおける従来の障壁を克服するために、ハイスループットのPerturb-Seq実験を可能にする次世代シーケンサー（NGS）ソリューションを提供しています。
ハイスループットのPerturb-Seq実験は、CRISPRベースのスクリーンを使用して、細胞集団内の焦点を絞った数個から数千の遺伝子を同時に破壊するワークフローに従います。一般的なCRISPRスクリーンには、CRISPR干渉、ノックアウト用のCRISPR-Cas9、およびCRISPR活性化が含まれます。CRISPRベースのスクリーンの後、細胞はシングルセルライブラリー調製のためにさらに処理されます。3 その後、ライブラリーはNovaSeq Xシリーズなどのハイスループットシーケンスシステムでシーケンスされ、そのデータはシングルセル解析パイプラインを用いて解析されます。
従来のプール型CRISPRスクリーンは、細胞の生存や適合性のリードアウトを含む1次元表現型を調査するのに優れていますが、Perturb-Seqは、個々の細胞の全ゲノム発現プロファイルをキャプチャーします。Perturb-Seq実験から得られた高次元トランスクリプトームシグネチャーは、高い表現型分解能を提供し、遺伝子制御ネットワークのマッピングを可能にします。3,4
| 機能 | 従来のプール型CRISPRスクリーン | Perturb-Seq |
|---|---|---|
| 表現型リードアウト | 低次元リードアウトは、細胞生存能力（生存）、増殖（適合性）、または蛍光活性化セルソーティング（FACS）に関する情報を、選択された少数の既定のマーカーに基づいて提供します | 高次元リードアウトであるscRNA-Seqは、全トランスクリプトームのシグネチャーをキャプチャすることで、従来のプール型CRISPRスクリーニングの範囲を拡大します |
| データ解像度 | バルク細胞集団の平均であり、細胞間の不均一性を覆い隠します | 転写状態の詳細なプロファイリングを提供する単一細胞分解能 |
| 一次出力メトリクス | シングルガイドRNA（sgRNA）の濃縮または除去（例：生存率や適合性スコア） | 各摂動ごとのトランスクリプトームの変化と差次的遺伝子発現 |
| 主なアプリケーション | 例えば、主要な細胞生存経路、必須遺伝子、薬剤耐性メカニズムの発見などです | 例としては、GRNのマッピング、潜在的な薬物標的の同定、およびトランスクリプトームレベルでのエピスタティックな相互作用の解明などがあります |
| スケールとスループットプロファイル | 1回のバルクランで、約5万～10万sgRNAの大規模な全ゲノムスクリーンまで拡張可能 | これまではターゲット型でしたが、新しいマルチオミクスとプローブベースのワークフローは全ゲノムの規模へと拡大しています |
Illumina Single Cell 3' RNA Prep
複雑なワークフローやマイクロ流体を必要とせず、シングルセル実験で高い転写産物と遺伝子の感度を提供するスケーラブルなRNA Prepキット。
NovaSeq Xシリーズの超ハイスループット生産規模のシーケンスシステムにより、全ゲノムなPerturb-Seq実験を、よりアクセスしやすく、効率的に行うことができます。
このワークフローは、シングルセルシーケンス解析を最適化し、イルミナのシングルセル3'RNA Prepでの使用に適しており、サードパーティのシングルセル調製もサポートしています。
直感的なマルチオミクスとマルチモーダル解析ソフトウェアにより、サンプルから洞察までの強力なワークフローを実現します。
ハイスループットゲノミクス、マルチオミクス研究、ゲノム規模のPerturb-Seqの進歩により、かつては想像もできなかった複雑な細胞パスウェイの解析に役立つ研究、およびNovaSeq Xシーケンシングシステムがゲノムの洞察をどのように加速しているかをご紹介します。
イルミナは、AIとヒトゲノミクスを使用した製薬パートナーとのコラボレーションを通じて、Billion Cell Atlasを世界最大の全ゲノム遺伝的摂動データセットとして構築しています。この膨大なリソースが、どのように多くの細胞タイプをカバーし、研究者が摂動予測、アノテーション、細胞状態、および薬物応答モデリングをより良く理解することが可能になるのかをご紹介します。このブレークスルー的データセットへのアクセス方法をご確認ください。
コストとワークフローの制限により、これまでscRNA-Seqを大規模に実施することは困難でした。Broad Clinical Labsの最高執行責任者であるSheila Dodge氏が、5日間で500万個の細胞をプロファイルするためのPerturb-Seqのスケーリングに関する洞察を語ります。
どちらも、遺伝的摂動をトランスクリプトームのリードアウトにリンクするシングルセルCRISPRテクノロジーです。CRISPRドロップレットシーケンス（CROP-Seq）とPerturb-Seqの主な違いは、ベクターデザインと、シーケンス中にガイドRNAがどのようにキャプチャーされ、同定されるかにあります。
初期のPerturb-Seqベクターにはシーケンス用の間接バーコードが含まれており、発生し得るレンチウイルス組み換えエラーにより制限され、バーコードがガイドから切り離される可能性がありました。CROP-Seqは、ガイドをトランスクリプトームにリンクし、組み換えエラーの可能性を回避することで、この問題を解決しました。現在のPerturb-Seqアッセイでは、直接キャプチャーベクターが主に使用されているため、従来の間接キャプチャー法はすでに使われなくなっています。5
CRISPRゲノム編集におけるNGSの詳細と、scRNA-Seqの利点をご覧ください。
従来、ドロップレットベースのシングルセルワークフローと、関連するCRISPR対応のシングルセルRNA調製キットは、サイエンティストにPerturb-Seqオプションを提供してきました。scRNA-Seqのコストとワークフローの制約の両方が、これらの実験のスループットと規模を制約しています。6さらに、プラットフォームの適合性は、スクリーンのスケール、リード深度要件、コストの制約など、いくつかの要因に依存します。
scRNA-Seqライブラリー調製にPIPseq（粒子テンプレートインスタントパーティションシーケンス）ケミストリーと高いシーケンス能力を備えたNovaSeq Xシステムを組み合わせることで、スケーラビリティとシーケンス効率を向上させることができます。
PIPseqケミストリーを用いたシングルセルRNAシーケンスが、スケーラブルで柔軟なシングルセルシーケンスワークフローで細胞レベルの洞察を明らかにし、新しいバイオマーカーを発見する方法をご覧ください。
NovaSeq X Plusシステムのデュアルフローセル機能が、どのように効率をさらに高め、Perturb-Seq試験の発見力を拡大できるかをご覧ください。
Perturb-Seqデータ解析パイプラインは以下の手順で定義されます。
1. マッピングと割り当て：生のシーケンスリードは、利用可能で定量化可能なデータに処理され、シングルセルトランスクリプトームと、個々の細胞を編集した特定のCRISPR gRNAを特定します。
2. 品質管理：厳密なフィルタリングを適用して、マルチレット、空のドロップレット、および編集を担当する特定のCRISPR gRNAが不明瞭な細胞を除去します。
3. 表現型解析：差次的遺伝子発現とクラスター解析は、遺伝的摂動によってグループ化された細胞に対して行われ、最終的には各編集がどのように細胞機能を変化させたかについての洞察を提供します。7
リード深度の要件は、実験デザイン、トランスクリプトームの複雑さ、および摂動効率などのいくつかの要因によって異なります。Perturb-Seq実験では、推奨リード深度は、要件に応じて、セルあたり数万リードから10万リード超までの範囲です。
はい、Perturb-Seqは全ゲノムなスクリーニング用にスケーリングできます。ダイレクトキャプチャーシングルセルケミストリーとハイスループットシーケンスシステムの進歩は、ゲノム規模の研究におけるPerturb-Seqの使用を制限していた過去のスループットとコストのボトルネックの緩和に貢献しています。7
遺伝子編集に関するPerturb-Seqの記事で、研究者がPerturb-Seqを使用してCRISPR-Cas9の摂動細胞の単一細胞分解能をより効率的に、前例のない規模で取得している方法をご覧ください。
NovaSeq X Sequencing Systemsの全ゲノムシーケンス機能についてご覧ください。
NovaSeq Xシリーズの全ゲノムなPerturb-Seq
約100万個の細胞で遺伝子発現パターンを変化させ、検証するためのハイスループットシングルセルCRISPRスクリーニング実験。
今後のマルチオミクスプロファイリング研究と解析を可能にするNGSソリューション。
超微量インプットとSingle-cell RNA-Seqワークフロー向けのハイスループットおよびロースループット対応ソリューション。
単一細胞解析、バルクセル解析、空間解析、およびメタゲノム解析を対象としたがん研究のためのNGSアプローチ。
創薬活動を支える情報をもたらし、ターゲット型治療薬の開発を支援するために設計された、革新的なゲノミクスソリューション。
Perturb-Seqソリューションの詳細については、専門スタッフにご相談ください。