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RNAシーケンス
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シングルセルと超微量インプットRNA-Seq

シングルセルRNAシーケンシングの紹介

複雑な生物系は、調和のとれた個々の細胞機能で決まります。バルクゲノムデータやトランスクリプトームデータを取得する従来の手法では、この生物系の複雑さをもたらす細胞の不均一性を解明することはできません。シングルセルシーケンスは次世代シーケンス（NGS）手法であり、個々の細胞のゲノムやトランスクリプトームを調べて細胞間のバリエーションについて高解像度で見ることができます。

超微量インプット手法とシングルセルRNAシーケンス（scRNA-Seq）手法で、研究者は複雑な組織内の個々の細胞の異なる生物学的探求を行い、環境要因に対する細胞の亜集団における反応を理解できます。高感度なscRNA-Seq手法は、分化、増殖、腫瘍形成などの時間依存的プロセスにおける細胞機能と不均一性の研究を強化します。 

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シングルセルRNA-Seqの利点

シングルセルおよび超微量インプットRNA-Seq手法は、最小限のインプットから偏りのない方法でトランスクリプトームを研究するための強力なツールです。シングルセルRNAシーケンスは多様な研究分野に適用でき、健康と疾患における細胞機能の理解を変革する可能性を秘めています。 

  • 高品質なサンプルに対して、シングルセルインプットレベルまでのロバストなトランスクリプトーム解析を実現
  • 全細胞を直接処理する統合プロトコールで、サンプルの完全性を保持します
  • 高解像度の解析により、バルクサンプリングおよびバルクRNA-Seq手法では通常見落とされてしまう細胞の違いを発見できます

シングルセルシーケンスと解析ワークフローの動画

シングルセルシーケンスでは、存在する細胞の種類が明らかになり、個々の細胞が複雑な生物系にどのように関わっているかを解明することができます。組織準備から解析に至るまで、イルミナのシングルセルシーケンスワークフローをどのように活用できるかをご覧ください。

起動モーダル

バルクRNA-SeqとシングルセルRNA-Seqの違い

バルクRNA-Seqは、組織全体に対する洞察の提供に優れています。研究者が全体像を理解するのに役立ち、新しい発見のためのターゲットを絞らないアプローチとして使用できます。しかし、バルクRNA-Seqは、幹細胞や血中循環腫瘍細胞などの、希少でありながら生物学的に重要な亜集団からの転写産物をキャプチャーできない場合があります。さらに、バルクRNA-Seqで同定された低発現遺伝子は、むしろ希少な細胞種では強く発現している可能性があります。

対照的に、シングルセルRNAシーケンスデータは個々の細胞に対して生成されるため、同じサンプル内の細胞間の微妙な違いについてより深い洞察を得ることができます。個々の細胞間のバリエーションは、同じ細胞亜集団を調べた場合でも非常に大きくなることがあります。これは特にトランスクリプトームに当てはまります。トランスクリプトームは、ゲノムとエピゲノムの相対的な安定性と比較して、反応性が高く動的なものです。複雑な臓器や組織を単一細胞レベルで検査することは、多くの疾患やシステムに対する理解を深めるために不可欠です。

ハイスループットおよびロースループットscRNA-Seq手法

シングルセルRNAシーケンス手法は、細胞スループットで区別できます。

ハイスループットのシングルセルプロファイリング法は、研究者が費用対効果の高い方法で1回の実験で何百～何百万もの細胞を調べる場合に推奨されます。

ロースループット法は、サイエンティストが1回の実験で数十～数百個の細胞を処理する必要がある場合に推奨されます。ロースループット法には、一般に機械操作やセルソーティング/パーティショニングテクノロジーが含まれます。

ハイスループットとロースループット両方のシングルセルRNA-Seq手法のワークフローを以下でご覧ください。どちらの方法も、イルミナの実績のあるSequence by Synthesis（SBS）化学を利用しています。イルミナのシーケンスシステムは、高いデータ精度と柔軟なスループットを実現し、規模に関係なくシングルセルシーケンシング研究に実績のあるNGSソリューションを提供します。

超微量インプットとシングルセルRNA-Seqのハイスループットワークフロー

この高感度でスケーラブル、そしてコスト効率の高いハイスループットscRNA-Seq手法を利用して、遺伝子発現における価値ある洞察を得ることができます。

超微量インプットとシングルセルRNA-Seqのためのロースループットワークフロー

特定の研究で、1回の実験で数十個から数百個程度の少数細胞の処理を希望する研究者には以下のロースループット手法をお勧めします。

シングルセルRNA-Seqデータ解析と洞察

DRAGEN Single-Cell RNA Pipeline

細胞分離装置を必要としないシンプルな手動ワークフローで、mRNAキャプチャー、バーコード設定、ライブラリー調製を行う、使いやすくスケーラブルなシングルセルRNA-Seqソリューション。

  • RNA-Seqアライメント、および転写産物リードに対するアノテーション済み遺伝子とのマッチング
  • バーコードリードのセルバーコードおよびUMIのエラー補正
  • 遺伝型に基づくデータおよび遺伝型に依存しないサンプルのデマルチプレックス法
Partek Flow

Partek Flowは、オンプレミスのスタンドアロン型三次マルチオミクス解析オプションを提供し、さまざまな商業的アッセイをサポートします。

  • 独自のデータや、定評のあるオンラインリポジトリから取得した公開データをインポート
  • バッチ効果を除去して、生物学的情報を探索
  • 疑似バルク解析を実行
Illumina Connected Multiomics

強力なクラウドベースのマルチオミクス解析および解釈ソフトウェアで、インタラクティブな視覚化、インフラストラクチャのスケーラビリティ、そして安全なデータ管理を備えた、サンプルから洞察までのワークフローを実現します。

  • 小規模なデータセットと大規模なマルチオミクス研究の両方に適し、複数のサンプルタイプをサポートします。
  • 結果をキュレーションした生物学的知識にリンクさせ、より深い解釈を可能にします。
  • 大規模で複雑なデータセットから洞察を得て、論文発表に適した図を取得します。

シングルセルシーケンスのアプリケーション

シングルセルシーケンスは幅広いアプリケーションに対応し、研究者は複雑な生物学的システムを理解する上で大きな進歩を遂げることができます。定評のあるアプリケーションには以下が含まれます。

  • がん研究：scRNA-Seqは、腫瘍の不均一性、希少な治療抵抗性細胞集団、免疫療法の奏功に関する画期的な研究を支えてきました。
  • 幹細胞生物学： シングルセルシーケンスアプローチにより、幹細胞亜集団における転写不均一性の特性評価が可能になります。
  • 神経生物学研究： 免疫学研究：scRNA-Seq法は、免疫細胞の発生、自己免疫疾患、希少な免疫細胞亜集団に関する研究を推進しています。
  • 神経生物学：研究者は、シングルセルRNA-Seqを利用して脳病理を研究し、疾患特異的なトランスクリプトームプロファイリング研究を行うことができます。
シングルセルトランスクリプトミクスにスポットライトを当てる

scRNA-Seqの新たなアプリケーションに関する詳細を学び、複雑な細胞生物学に関する深い洞察を手にしてください。

シングルセルRNA-Seqのよくある質問

シングルセルRNAシーケンスは、個々の細胞レベルで遺伝子発現をプロファイリングするために使用され、複雑な細胞表現型の高解像度ビューを可能にします。この方法では、単一細胞レベルでの細胞不均一性と遺伝子発現の動的変化を明らかにします。1
scRNA-Seqは、がん研究、免疫学、自己免疫、幹細胞生物学、発生生物学、神経科学など、基礎研究、トランスレーショナル研究、臨床研究の分野で幅広い有用性があります。この強力な手法は、不均一な細胞集団の研究、希少な細胞タイプの発見、および細胞レベルでの疾患と発生のプロセスの特性評価に使用されます。1,2
バルクRNA-Seqアプローチとは異なり、シングルセルRNA-Seqは、非常に不均一な細胞集団内の特定の細胞について詳細な転写プロファイルを提供します。このレベルの解像度は、腫瘍を含む複雑な組織や免疫細胞集団において特に重要です。さらに、シングルセルRNA-Seqは、希少で存在量の少ない転写産物を検出し、新規の転写アイソフォームと制御メカニズムを特定し、疾患病理の理解を深める高感度の方法です。
シングルセルRNAシーケンスは、各細胞でどの遺伝子が発現しているか、細胞表現型がトランスクリプトームシグネチャーに基づいてどのように異なるか、遺伝子発現が環境、疾患プロセス、および治療によってどのように影響されるかを明らかにすることによって、細胞アイデンティティと機能の高解像度スナップショットを提供します。例えば、シングルセルRNAシーケンスは、転写シグネチャーを介して特定の免疫細胞亜集団を同定し、特徴づけ、細胞運命の決定の可能性を明らかにするために使用できます。3
技術的な問題や生物学的要因により、シングルセルRNAシーケンスデータは、バルクRNAシーケンスと比較して、より多くのノイズと複雑性を有すると報告されています。scRNA-Seqデータには大きなばらつきがあるため、計算解析やデータ解釈が困難になる可能性があります。4 さらに、シングルセルRNAシーケンスの普及は、スケーリングが限られており、試薬コストが高く、特殊な資本設備の必要性があるため、遅れています。
Illumina Single Cell 3' RNA Prepキットでは、高価なマイクロ流体装置や複雑なワークフローを必要とせずに、シングルセルmRNAのキャプチャー、バーコード、ライブラリー調製がどのように可能になるかをご覧ください。
PIPseqケミストリーは、スケーラブルかつシンプルなシングルセルRNAキャプチャーとバーコード化を可能にします。粒子テンプレートインスタントパーティション（PIP）は、ハイドロゲルビーズに結合したバーコードオリゴヌクレオチドを含むテンプレート粒子との乳化を用います。サンプル調製中、目的の細胞懸濁液をテンプレート粒子およびオイルと混合し、ボルテックスによりテンプレート化されたエマルジョンに分離します。次に、エマルジョン内の細胞が溶解され、バーコードテンプレートによってmRNAがキャプチャーされます。エマルジョンが破壊され、キャプチャーしたmRNAから逆転写によりcDNAが生成され、増幅されて個々の細胞ごとにcDNAライブラリーが作成されます。次に、シングルセルcDNAライブラリーは、標準的なライブラリー調製法を用いてシーケンスライブラリーに処理され、その後NGSが行われます。
Illumina Single Cell 3' RNA Prepキットのページでは、scRNA-SeqアプリケーションにおけるPIPseqケミストリーの使用について詳しくご紹介しています。
最適なシーケンス深度は、RNA含有量が異なるサンプルタイプ、望ましい実験結果、シーケンスプラットフォームのスループット能力など、多数の要因に依存します。
Illumina Single Cell 3' RNA Prepキットでは、サンプルタイプ間でキャプチャー効率にばらつきがあるため、推奨されるシーケンスリード深度は、キャプチャーされた細胞の予想数ではなく、インプットセルあたりのリード数（RPIC）を使用して計算されます。
詳細については、シングルセルRNA調製に関するFAQおよびリソースページをご覧ください。
シングルセルRNAシーケンスの推奨細胞数は、実験目標と望ましい方法によって異なります。Illumina Single Cell 3' RNA Prepキットでは、約100～200,000個の細胞がシングルセルRNAシーケンスに推奨されます。
詳細については、ワークフローと仕様表が簡略化されたIllumina Single Cell 3' RNA Prepキットのページをご覧ください。
シングルセルRNAシーケンスは、新鮮、凍結、DSP-メタノール固定細胞や核、およびさまざまな種の全組織検体など、多様なサンプルで実施できます。さらに、scRNA-Seqは、細胞培養、血液、オルガノイドなどのさまざまな生物学的ソースに適用できます。5
シングルセルRNAシーケンス用に組織からシングルセル懸濁液を調製するには、組織を個々の細胞に分離する必要があります。これは通常、機械的手法と酵素的手法の組み合わせによって達成されます。厳しい条件は細胞にストレスを与え、遺伝子発現に影響を与える可能性があるため、細胞収量と生存率のバランスを取るには慎重な最適化が不可欠です。6
シングルセルRNAシーケンスは通常、新鮮細胞に対して行われますが、DSP-メタノール固定細胞または凍結細胞を使用することができます。ただし、限界と考慮事項があります。凍結は細胞死、RNA分解、遺伝子発現プロファイルの変化を引き起こす可能性があります。
凍結細胞を使用する場合は、凍結および融解中の損傷を最小限に抑えるため、シングルセル懸濁液で開始し、適切な培地で細胞を凍結保存することが推奨されます。凍結組織では、融解後に生細胞を解離し回収する課題があるため、単一細胞を分離するよりも、単一核RNAシーケンス（snRNA-Seq）がしばしば好まれます。7
ポリアデニル化RNAを持つすべての種は、Illumina Single Cell 3' RNA Prepキットで使用できます。
詳細については、Illumina Single Cell 3' RNA Prepキットの特徴と利点をご覧ください。

シングルセルシーケンスに関するリソース


シングルセルに関するウェビナー
シングルセルデータの探索方法
シングルセルデータの探索方法

このプレゼンテーションでは、三次的scRNA-Seq解析における基本的なステップを紹介し、さまざまな細胞集団が外的要因にどのように反応するかに焦点を当てます。

シングルセルRNAシーケンス
複数部位にわたるシングルセルRNAシーケンス

テクノロジーの進歩により、一つのワークフローで複数のサイトからのシングルセルRNA-Seqが可能になりました。データ品質、脆弱な細胞タイプの回復などについて説明します。

シングルセルマルチオミクス
シングルセルマルチオミクス：RNA-Seqを超えて

Dr. Michael Kellyは、シングルセルシーケンス法を使用して聴覚の発達を研究し、NCIがん研究センターの研究をサポートしています。

主なアプリケーションノート
NextSeq 1000およびNextSeq 2000シングルセルRNAシーケンスソリューション

この費用対効果の高い柔軟なワークフローでは、シングルセルの遺伝子発現を測定でき、通常はバルクサンプリングメソッドでマスクされた細胞の違いを探索できる高解像度分析が可能になります。

シングルセル遺伝子発現 + ATAC-Seqソリューション

単一細胞の遺伝子発現とクロマチンアクセシビリティを統合し、遺伝子制御を行う細胞内メカニズムを明らかにします。

 NextSeq 1000および2000システムによるシングルセルおよび空間シーケンス

XLEAP-SBS手法と10xゲノミクスシングルセルおよび空間ソリューションを組み合わせることで、NextSeq 1000およびNextSeq 2000システム上で高解像度のゲノミクスが可能になる仕組みをご紹介します。

シングルセルシーケンスに関する考察、動向、今後について

クローン病やピーナッツアレルギーから細胞治療や免疫療法まで、NIHR Guys' and St. Thomas' Biomedical Research Centreのラボでは、シングルセルゲノミクス研究にイルミナテクノロジーを使用しています。

シングルセルシーケンスに関する考察、動向、今後について
ヒト腫瘍の免疫プロファイリングにより、神経膠芽腫のコンビナトリアルターゲットとしてCD73を同定

免疫療法研究におけるシングルセルRNAシーケンス

MD Anderson Cancer CenterのSwetha Anandhanは、イルミナと10x Genomicsとともにこのウェビナーに登壇します。彼女は、多形性膠芽腫において、免疫チェックポイント阻害剤による治療後も持続するマクロファージ集団を特定するために使用したシングルセルRNAシーケンスについて解説しています。

ウェビナーを閲覧

その他の情報
がんシングルセル解析

NGSによるシングルセルシーケンスは、個々のがん細胞のゲノムまたはトランスクリプトームを調べ、細胞間のバリエーションを高解像度のビューで表示できます。

CITE-Seq

CITE-Seq（トランスクリプトームとエピトープの細胞インデックス）は、単一細胞のリードアウト内で細胞表面タンパク質とトランスクリプトームデータを同時に定量するシーケンスベースの手法です。

トランスクリプトミクス

トランスクリプトームのプロファイリングは、生物学的な理解を高めます。さまざまな手法を調べ、RNA-seqの検出力がいかに影響力の高い研究を強化できるかを確認してください。

マルチオミクス

ゲノミクス、トランスクリプトミクス、エピジェネティクス、プロテオミクスからのデータを組み合わせることで、遺伝子型と表現型のつながりをより正しく理解できます。

ATAC-Seq

バルク細胞集団または単一細胞のいずれかにおいて、ゲノム全体のオープンクロマチン領域を高解像度で評価します。

腫瘍微小環境を探る

Dr. Alex Swarbrickが、乳がんと前立腺がんにおける腫瘍微小環境の研究におけるシングルセルシーケンスの利点について説明します。

関連ソリューション

シーケンスによるタンパク質の検出

個々の細胞で、RNAのシーケンスと細胞外タンパク質の検出を同時に実行して、疾患に関連した新しい種類の細胞と状態を明らかにできる手法。

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ATACシーケンス

ATAC-Seqは、高活性トランスポザーゼTn5を使用してクロマチンアクセシビリティを評価するために広く利用されている手法です。高解像度でシングルセルに対して実施することができます。

ATAC-Seqの詳細はこちら
がんRNAシーケンス

RNA-Seq を用いて、がん遺伝子の発現およびトランスクリプトームの変化を検出し、新規がん転写産物を同定します。

詳細はこちら
細胞および分子生物学

次世代シーケンサー（NGS）で、従来の手法を超えた細胞および分子生物学の研究を発展させます。

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参考文献

  1. Jovic D, Liang X, Zeng H, Lin L, Xu F, Luo Y. Single‐cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 2022;12(3):e694. doi:10.1002/ctm2.694
  2. Baccin C, Al-Sabah J, Velten L, et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveals the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization. Nat Cell Biol. 2020;22(1):38-48. doi:10.1038/s41556-019-0439-6
  3. Papalexi E, Satija R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nat Rev Immunol. 2018;18(1):35-45. doi:10.1038/nri.2017.76
  4. Chen G, Ning B, Shi T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Front Genet. 2019;10:317. doi:10.3389/fgene.2019.00317
  5. Sant P, Rippe K, Mallm JP. Approaches for single-cell RNA sequencing across tissues and cell types. Transcription. 2023;14(3-5):127-145. doi:10.1080/21541264.2023.2200721
  6. Wiegleb G, Reinhardt S, Dahl A, Posnien N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 2022;19(1):27. doi:10.1186/s12983-022-00472-x
  7. Stamper CT, Marchalot A, Tibbitt CA, et al. Single-cell RNA sequencing of cells from fresh or frozen tissue reveals a signature of freezing marked by heightened stress and activation. Eur J Immunol. 2024;54(4):e2350660. doi:10.1002/eji.202350660
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