腫瘍の微小環境を探る
シングルセルシーケンスは、腫瘍の細胞間通信の検出に非常に有用であることが証明されています。
腫瘍微小環境を調べる
はじめに
一部のがんが遠隔の臓器や組織に浸潤するために転移するのはなぜですか？ また、転移性腫瘍の中には薬剤耐性を示すものがあるのはなぜですか？ 研究者が答えるのは非常に難しい質問でした。多くの人が、原因を腫瘍細胞自体に突き止めています。しかし、これらのセルの内部の働きが挙動を完全には説明していないことが明らかになりました。研究者は、腫瘍微小環境の役割要素を調べながら、研究の範囲を拡大しました。これには、血管、免疫細胞、線維芽細胞、 腫瘍を取り囲む細胞外マトリックスが含まれます。この研究は、がん細胞が体内の他の部位に移動し、薬剤耐性になる方法と理由について、劇的な洞察をもたらしています。
Alex Swarbrick准教授は、オーストラリアのシドニーにあるGarvan Institute of Medical Researchの腫瘍進行研究室長です。彼の研究では、シングルセルRNAシーケンス（scRNA-Seq）などのシングルセル技術を使用して、乳がんや前立腺がんの腫瘍微小環境を調べています。目標は、その中の遺伝子発現パターンを解明し、将来のがん治療のための潜在的なターゲットを特定することです。
iCommunityは、Swarbrick博士と、シングルセル次世代シーケンス（NGS）技術の利点と、腫瘍微小環境の理解が、より強力ながん対策治療用武器の開発にいかに不可欠であるかについて話しました。
Alex Swarbrick博士は、Garvan Institute of Medical Researchの腫瘍進行研究室長です。
Q：Garvan Instituteに入社したのはいつですか？
Alex Swarbrick（AS）：ガーバン研究所に12年間在籍しています。以前は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の博士課程の研究員でした。Garvan Instituteでの私の仕事は、細胞ゲノミクスに重点を置いています。ヒトの疾患を理解するためにシングルセル法を使用しています。細胞ゲノミクスに関するエキサイティングなことの1つは、人間に直接働きかけて、基礎的なトランスレーショナルな発見を行えることです。次に、実験モデルを使用して逆向きに働き、疾患のメカニズムを特定するのに役立ちます。
多くのラボでは、がん、自己免疫疾患、免疫学、神経生物学など、細胞ゲノミクスが疾患に対する新しい洞察を提供する機会に気づいています。細胞ゲノミクス研究は、ガーバン研究所の多くのラボで実施されています。また、イスラエルのWeizmann Institute of Scienceと提携し、ガーバン-Weizmann Centre for Cellular Genomicsを設立し、この新しい分野に研究を集中させました。
Q：腫瘍微小環境は疾患にどのような影響を与える可能性があるか？
AS：腫瘍微小環境は、悪性細胞だけでなく、腫瘍を構成するすべての細胞で構成されています。腫瘍内の他の細胞は単なる乗客ではなく、疾患進行の活発な参加者であるという認識が高まっています。基本的に、がんは生態系のように作用します。そのエコシステムのすべての構成要素を理解すれば、その行動についてより深い洞察を得ることが期待できます。これには、新たな転移性病変を形成する能力と治療に対する反応が含まれます。
Q：微小環境の他のどの細胞ががんの発症と進行に関与している可能性がありますか？
AS：最も明白なのは、微小環境の免疫細胞です。免疫系が最初からがんの進行を形作る役割を果たすことは明らかです。私たちの生涯において、私たち全員が変異のプロセスを通して異常細胞を発達させます。多くの場合、免疫系はこれらの細胞を認識し、排除します。まれに、変異細胞が免疫系を回避し、がんに進行するための戦略を立てることがあります。これらの戦略に対抗するために、PDPD1, PDL1CTLA4を標的とする免疫チェックポイント薬など、現在開発中および臨床で使用されているがん治療があります。
微小環境には、エビデンスがあまり明確でない細胞成分が他にもありますが、重要な役割を担っていると考えられます。線維芽細胞を含む間質細胞に関心があります。これらの細胞は腫瘍の大部分を占め、機械的役割を果たします。例えば、線維芽細胞は腫瘍の硬さや体液の量を決定します。しかし、線維芽細胞は腫瘍内の他の細胞とも交信し、その行動に影響を与えます。がんや免疫細胞と通信しています。
Q：がんにおける線維芽細胞の役割を理解することで、どのように新しい治療法の開発が促進されるでしょうか？
AS：線維芽細胞が治療に反応して腫瘍の挙動に影響を与えることを示すために、過去20年間、実験系でいくつかの美しい研究が行われてきました。侵攻性トリプルネガティブ乳がんでは、線維芽細胞が悪性で薬剤耐性のあるがん行動を促進するニッチを形成することが示されています。1 低分子阻害剤でこれらの線維芽細胞をターゲットにする方法を見つけることができれば、そのサポートの提供を停止し、がん細胞により良い応答をもたらすよう感作することができます。実験モデルで成功し、第I相試験を実施して、このような戦略の実現可能性を実証しました。これは、線維芽細胞または間質細胞を標的にして、がん治療のための新しい武器を作ることを裏付ける初期のエビデンスの例です。
"基本的に、がんは生態系のように作用します。そのエコシステムのすべての構成要素を理解すれば、その行動についてより深い洞察が得られると予想されます。"
Q：がん微小環境を最初にどのように調査しましたか？
AS：免疫組織化学法やフローサイトメトリーなどの手法を用いて腫瘍から細胞を分離し、異なるチューブに分けることができました。次に、細胞プールでRNA-Seqを使用して、その生物学を理解しました。その仕事は私たちを長い道のりに導いてくれましたが、大変な労力を費やし、チューブ内に不均一な細胞集団が残っていました。
Q：シングルセルシーケンスにより、腫瘍内の異なる細胞タイプを分解するにはどうすればよいでしょうか？
AS：細胞は生命と疾患の根本的な単位です。何百万人ものヒトの疫学研究が集団の行動を理解することを可能にするのと同様に、新しい洞察を得るためには、細胞レベルで生物学的システムを研究することも不可欠です。
シングルセルシーケンスを用いることで、がんの微小環境において何が得られるかについての先入観から始める ことがなくなりました。発見したことを観察し、強調することができます。そうでなければ得られなかったであろう新しい洞察が生まれました。例えば、乳がんの研究では、平滑筋細胞と呼ばれる間質細胞の集団が発見され、乳がんのこの状態（未発表）には存在しなかったことがわかりました。過去20年間、これらの細胞は同じマーカーの一部を発現するため、線維芽細胞であると考えられました。異なる細胞型であることに気付いたことはありませんでした。
臨床試験を実施しているため、限られた量の組織で作業しています。多くの場合、1つのアッセイのみを実行するのに十分なサンプルがあります。そのため、私たちは1つのサンプルからできるだけ多くのことを学んできました。当社は、1つのサンプルから複数の次元のデータを提供するマルチオミクス手法に投資してきました。例えば、NovaSeq 6000システムでは、scRNA-Seqを実行して、サンプルあたり数千の細胞の完全なトランスクリプトームとターゲット化した細胞表面プロテオームを取得します。当社は、レパートリーとシーケンスによる遺伝子発現（RAGE-Seq）と呼ばれる手法を開発しました。この手法により、リンパ球受容体などの情報が重要な分子に対して、完全長の単一分子シーケンスを同時に実行することができます。2また、細胞トランスクリプトームのインデックスやシーケンスによるエピトープ（CITE-Seq）などの他のラボで開発された手法も採用し、scRNA-Seqと同時にタンパク質測定を実施することができます。CITE-SeqとNextSeq 500システムを使用して、数千の単一細胞の表面にある150の異なるタンパク質に関するデータを取得できます。
"弊社は、1つのサンプルから複数の次元のデータを提供するマルチオミクス手法に投資してきました。例えば、NovaSeq 6000システムでは、scRNA-Seqを実行して、サンプルあたり数千の細胞の完全なトランスクリプトームとターゲット化した細胞表面プロテオームを取得します。"
Q：異なる種類の間質細胞と、細胞間シグナル伝達におけるその役割をどのように特定しましたか？
AS：シングルセルNGS技術を使用して、がん内に存在するさまざまな間質状態を特定しました。いわゆる筋線維芽細胞、炎症性線維芽細胞、および2種類の平滑筋細胞（未発表）を含む4つの異なる間質集団を特定しました。その遺伝子発現特性に基づいて、細胞の種類を同定し、発現している分子の種類を予測し、隣接細胞にシグナルを送っている分子を同定することができます。
私たちが現在追求している仮説は、乳がん患者の間質微小環境の性質が、免疫システムが腫瘍細胞を除去する能力があるかどうかを部分的に左右する可能性があるということです。以前は、線維芽細胞ががん細胞にシグナル伝達し、がん細胞をより攻撃的にするエビデンスが発見されていました。また、腫瘍微小環境内で免疫系のキラー細胞であるCD8+ T細胞に線維芽細胞がシグナル伝達し、これらのT細胞ががん細胞を殺傷する効果を低下させている（未発表）というエビデンスも発見されました。このシグナル伝達は、現在の世代の乳がん免疫療法がなぜ効果がないことが多いのかを部分的に説明している可能性があります。
現在、このシグナル伝達を阻害することで乳がんの抗腫瘍免疫を強化できるかどうかを試験するために実験システムを使用しています。間質微小環境からの抑制メッセージを遮断する薬剤に加えて、患者がいつか免疫療法を受けるシナリオを想像できます。
Q：転写特性によって腫瘍内の不均一性はどのように明らかになりますか？
AS：がん細胞を含む腫瘍内のすべての細胞タイプに多様性があります。しかし、その不均一性の要因は依然として解明されていません。タモキシフェンやアロマターゼ阻害剤などのscRNA-Seq.Endocrine療法を用いた不均一性が、何十万人もの命を救う大きな成功を収めていることを研究し始めました。しかし、多くの女性はこれらの薬剤による治療後も再発しています。すべての症例で再発の性質が理解できるわけではありません。エストロゲン受容体の変異によって引き起こされることもありますが、この領域を研究する研究者が多数います。その他の場合、治療中の細胞集団内の不均一性によって引き起こされる可能性があります。内分泌に依存しない細胞集団があり、これらの女性を効果的に治療する内分泌療法の失敗を説明できる可能性があります。
"ある意味では、イルミナのシステムは目に見えなくなりました。データを入手し、良いことを知っています。そして、先に進みます。イルミナのシステムは、非常に優れた性能を発揮しています。"
転写因子であるため、scRNA-Seqなどのシングルセルゲノム技術でエストロゲン受容体の活性を容易に測定し、多様な細胞集団を評価し、内分泌抵抗性細胞集団を同定することができます。これらの集団を排除するための脆弱性をいつか特定することを期待しています。この研究は、最終的に再発リスクの高い女性のための併用療法の開発を促進する可能性があります。
Q：イルミナのNGSシステムは、あなたの研究でどのように機能しましたか？
AS：イルミナのNGSシステムは、ハイスループットシーケンスのあらゆるニーズに対応します。当社は貴重な臨床サンプルを扱うトランスレーショナル研究を実施しているため、試薬が信頼性が高く、一貫性があり、高品質であるテクノロジープラットフォームが必要です。ある意味では、イルミナのシステムは目に見えなくなりました。データを入手し、良いことを知っています。そして、先に進みます。イルミナのシステムは、初期well.Inには。当社のシングルセルシーケンスパートナーであるニューサウスウェールズ大学のRamaciotti Centre for Genomicsは、大容量シーケンスのためにNovaSeq 6000システムを取得し、2019年初めに使用を開始しました。当社は同僚と協力して、サンプルをバッチ処理してシーケンスランを充填し、規模の経済から利益を得ることができます。その結果、シーケンスコストが下がり、データもこれまでと同様に良好になりました。
Q：研究の次のステップは何ですか？
AS：一般的ながんの理解のギャップを埋めるために、より多くの細胞ゲノミクスを実施します。前立腺がんでは、早期限局性疾患および転移性疾患を対象とした研究が進行中です。前立腺がんにはある程度の不均一性があります。前立腺がんを研究する病理学者は、その複雑な組織病理学のために、多くの場合、その疾患を専門とする必要があります。前立腺内には複数のがんの焦点が存在しますが、これらのがんは動的間質リモデリングに囲まれています。これは、純粋な形態学研究からより深い遺伝子洞察に移行することで、多くのことを学べるエキサイティングな研究分野です。NGSヒットをフィルタリングし、その関連性をテストするために実験システムに戻すための適切な方法を見つけるために、多くの努力を払っています。このアプローチを使用すると、現象の観察から、メカニズム上または治療上重要なものへと移行できます。
Q：がん研究におけるNGSシーケンスの使用において、今後どのような傾向が見られると思いますか？
AS：1つの傾向は、空間RNAプロファイリングと関連技術です。現在、ほとんどのシングルセルゲノミクス研究は細胞懸濁液の作製から始まります。したがって、これらの細胞における空間的、形態的、および位置的情報が失われます。
新しいテクノロジーにより、組織における細胞分解能シーケンス研究を実施できるようになりました。そうすることで、細胞の形態と、細胞間のシグナル伝達を同定し、実証するために重要な他の細胞との空間的関係に関する情報を維持することができます。とても刺激的で、これらの新しいテクノロジーから学ぶことを楽しみにしています。
Garvan Instituteのシーケンスの詳細はこちら：
詳細はこちら：
NextSeq 500システム：このシステムは廃止されました。代替品として NextSeq 1000および2000システムを推奨します。
参考文献
- Cazet AS, Hui MN, Elsworth BL, et al. 間質リモデリングとがん幹細胞の可塑性をターゲットにすることで、トリプルネガティブ乳がんの化学抵抗性を克服できます。Nat Commun . 2018;9:2897. doi: 1038/s41467-05220-6.
- Singh M, Al-Eryani G, Carswell S, et al. ハイスループットターゲットロングリードシングルセルシーケンスは、リンパ球のクローンおよび転写ランドスケープを明らかにします。Nat Commun . 2019;10(1):3120. doi: 10.1038/s41467-019-11049-4.