CRISPRゲノム編集により、研究者は遺伝子改変細胞株や動物モデルを迅速かつ精確に作製することができます。遺伝子ノックアウトの作製や特異性の高い改変の他にも、研究者はCRISPR技術によりゲノム配列を変化させずに阻害（CRISPRi）や活性化（CRISPRa）を介して遺伝子発現を調節することができます（表）。

ゲノム操作	応用	必要なコンポーネント	例
ノックアウト	特定の遺伝子の機能破壊は多種多様な改変から生じます	Cas9（またはCas9ニッカーゼ）、欠損を組み込む編集を導入するシングル（またはデュアル）gRNA	21、22、23
編集	特定のゲノム位置での特定の配列改変の実行	Cas9（またはCas9ニッカーゼ）、編集する領域を標的とするシングル（またはデュアル）gRNA、修復テンプレート	24、25、26、27、28、29、30
阻害（CRISPRi）、または活性化（CRISPRa）	ゲノム配列の永続的な改変なしで遺伝子の発現を増減	dCas9またはdCas9-リプレッサーまたはdCas9-アクチベーター、標的遺伝子のプロモーターエレメントを標的とするgRNA（1つまたは複数）	31、32、33、34

CRISPRゲノム編集実験からは細胞集団が混じり合ったものが得られ、その中の小さなサブセットのみで目的の編集がされています。研究者は、どの細胞に目的のCRISPRノックアウトや標的変異があるのかを判断する必要があります。編集を評価する現行の手法には、切断アッセイ、PCR、サンガー法、およびNGSなどがあります（表）。

NGSは、全ての種類の改変にわたり高解像度で定性的情報も定量的情報も得ることができ、あらゆるスループットのニーズに対応でき、オフターゲット効果のモニタリングにも使用できる唯一の方法です。⁷ NGSを用いるターゲットシーケンスは、改変の標的領域に注目することでCRISPRによる編集を確認できるコスト効率の高いソリューションです。

ターゲットシーケンスの詳細はこちら

オンターゲット評価の種類	特定される変異の種類	結果	情報量	スケール
切断アッセイ	シングルミスマッチまたはインデル	半定量	少ない	ロースループット～ハイスループット
PCRとRFLP	HDR挿入	定量	少ない	ロースループット～ハイスループット
PCR	欠失	定量	少ない	ロースループット～ハイスループット
サンガー法	全ての編集	定量 + 定性	多い	ロースループット
NGS	全編集、全ゲノムオフターゲット効果	定量 + 定性	多い	ロースループット～ハイスループット

CRISP/Cas9技術の実施を成功させるには、目的のターゲット以外の部位における意図しない改変であるオフターゲット効果を特定し、低減するストラテジーなどが必要となります。ゲノム編集実験では、RNAの特異性を評価し、オフターゲット部位を予測する計算法が広く使用されています。

オンラインツールやウェブベースのアルゴリズムが公開されています（表）。ただし、予測アルゴリズムでは見逃されるおそれのあるオフターゲット部位を発見するには、NGSによる全ゲノムシーケンス（WGS）などの全ゲノム解析が必要です。⁸

WGSの詳細はこちら

オフターゲット解析ツール	ウェブサイト
Benchling	https://benchling.com
Cas-OFFinder	http://www.rgenome.net/cas-offinder
MIT CRISPR　Design Tool	http://crispr.mit.edu
Deskgen	https://www.deskgen.com/landing
DNA 2.0 CRISPR gRNA　Design Tool	https://www.dna20.com/products/crispr#4
E-CRISP	http://www.e-crisp.org/E-CRISP
EuPaGDT	http://grna.ctegd.uga.edu
GenScript gRNA　Design Tool	http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html
ZiFiT	http://zifit.partners.org/ZiFiT
Broad GPP Portal	http://portals.broadinstitute.org/gpp/public
CROP-IT	http://cheetah.bioch.virginia.edu/AdliLab/CROP-IT/homepage.html

オフターゲット切断部位のスクリーニングのための全ゲノムアプローチには、細胞ベースアッセイとin vitroアッセイがあります（表）。

方法	種類	内容	利点	欠点
IDLV捕捉（インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター捕捉）	細胞ベース（生細胞）	選択可能なマーカーを持つIDLVのDSB部位への組み込み。LAM-PCRによる組み込み部位の回復。ハイスループットシーケンス。	生細胞内でDSBを特定できます	比較的低感度
GUIDE-Seq（Genome-wide unbiased identification of DSBs enabled by sequencing）	細胞ベース（生細胞）	DSBを二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（dsODN）でタグ付け。特定の増幅をタグ付け。ハイスループットシーケンス。	シンプル、効率的、精確、かつ簡単なプロトコール。データ解析用オープンソースソフトウェアを利用可能。	dsODNの効率的な導入は細胞に害を及ぼす可能性あり。in vivoでは未検証。
HGTST（High-throughput genome-wide translocation sequencing：ハイスループット全ゲノム転座シーケンス）	細胞ベース（生細胞）	2つのヌクレアーゼの発現によるプレイDSBとベイトDSBの生成。ベイトDSB接合部に対するビオチン化プライマーの使用。プレイとベイト間の転座解消のためにlinear amplification mediated PCR（LAM-PCR）法の実施。ストレプトアビジンを用いる濃縮。ハイスループットシーケンス。	導入が必要なのは編集する複合体のみ。in vivoで使用できる可能性あり。	ヌクレアーゼが誘導する転座は稀な事象であり、同一染色体上にある部位の間で発生する傾向にある。
BLESS（Breaks labelling, enrichment on streptavidin and next-generation sequencing）	細胞ベース（固定細胞）	処理済み細胞の単離および固定。インタクトな核の単離および透過処理。一過性のヌクレアーゼ誘導DSBへのアダプターのin situライゲーション。濃縮。ハイスループットシーケンス。	Cas9がin vivoで導入された組織において使用されている。内因性のDNA修復機構とは無関係。	技術的に困難。特定の時点に存在するDSBのみ特定可能。透過処理前のDSBは特定不可。
Digenome-Seq（Digested genome sequencing）	In vitro	In vitro処理細胞からゲノムDNAを単離。シーケンスアダプターのライゲーション。全ゲノムシーケンス。	細胞ベースの要因に関連した制限なし	シーケンス効率が低い。バックグラウンドノイズが高い。
CIRCLE-seq（Circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing）	In vitro	ゲノムDNAがせん断され、分子内ライゲーションにより環状化される。不要な直鎖DNA分子は分解される。切断部位を持つ環状DNA分子は元のCRISPR複合体と共に再度直線化されるため、新たに切断されたDNA末端が遊離してアダプターライゲーション、PCR増幅、ハイスループットシーケンスが行われる。	細胞ベースの要因に関連した制限なし

シングルセルRNAシーケンス

CRISPR改変後に細胞集団をスクリーニングして、何千もの個々の細胞において同時に多数の遺伝子の遺伝子制御の影響を判定

RNAシーケンス

トランスクリプトーム全体または遺伝子／遺伝子ファミリーの発現に対する変異の影響を評価

ChIP-Seq

DNAとタンパク質の結合に対する変異の影響を判定

メチル化シーケンス

メチル化状態およびクロマチンリモデリングに対する変異の下流影響を調査

NextSeq 1000 & 2000 Systems

Groundbreaking benchtop sequencers allow you to explore new discoveries across a variety of current and emerging applications, with higher efficiency and fewer restraints.

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Illumina Stranded mRNA Prep

A simple, scalable, cost-effective, rapid single-day solution for analyzing the coding transcriptome leveraging as little as 25 ng input of standard (non-degraded) RNA.

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TruSeq ChIP Library Preparation Kit

Simple, cost-effective chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) DNA library preparation, with master mixes and robust multiplex capabilities.

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TruSeq Methyl Capture EPIC Library Prep Kit

This kit combines next-generation sequencing with epigenetic insights to accelerate biomarker discovery and understand methylation’s role in gene regulation.

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オンターゲットやオフターゲットの高解像度評価やCRISPRノックアウトや編集の機能に関する検証や評価の他にも、NGSはCRISPRゲノム編集ワークフローの別の段階に取り入れることができます。

初期設計段階において、（リファレンスゲノムのない種の）座位またはゲノムのリシーケンスはRNAの選択に役立ちます。CRISPR-Cas9とガイドRNAコンストラクトのクローニングプロセス中、得られたプラスミドをリシーケンスすることで、特に大きなプラスミドライブラリーのあるハイスループット実験の場合、CRISPR導入ベクターを迅速かつ高い信頼度で検証できます。

Francis deSouzaによるゲノミクス、CRISPR、未来

Illumina, Inc.の社長兼CEOであるFrancis deSouzaが、Aspen Ideas: コロラド州の健康は、医療全体におけるゲノミクスの影響と、より多くの人々にその利益をより迅速に提供することの緊急性について聴衆を教育します。

記事を読む

アグリゲノム

シンプルかつ低コストのCRISPR-Cas9技術は、作物における遺伝子編集を多数の汎用種から農学的に重要な多種多様な種にまで広げることができます。

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がん研究

迅速かつシンプルなCRISPR-Cas9技術により、新たながんモデルの開発および免疫療法の新しい標的やストラテジーの発見が可能になります。

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複雑な疾患ゲノミクス

精確なCRISPR-Cas9ゲノム編集により、疾患病理を調べるためにヒトの複雑な疾患の細胞モデルや動物モデルを開発することが可能になります。

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細胞分子生物学研究

迅速、シンプル、かつ低コストのCRISPR-Cas9ゲノム編集は、遺伝子ノックアウトやトランスジェニックモデルの開発における細胞分子生物学に革命をもたらしました。

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NGSテクノロジー

超高スループット、スケーラビリティ、およびスピードにより、生物学的な理解がこれまでになく可能になります。

NGSを探求する

論文集

これらの査読付き論文の要約は、イルミナのテクノロジーが科学研究をどのように推進しているかを強調しています。

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参考文献

Cong L, Ran F A, Cox D, et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science.2013;339:819-823.
Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013;339:823-826.
Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, Bilate AM, Ingram JR, Ploegh HL.Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining.Nat Biotechnol.2015;33:538-542.
Chu VT, Weber T, Wefers B, et al.Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells.Nat Biotechnol.2015;33:543-548.
Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, et al.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.Cell.2013;152:1173-1183.
Cheng AW, Wang H, Yang H, et al.Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.Cell Res.2013;23:1163-1171.
Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Nat Protoc.2013;8:2281-2308.
Tsai SQ, Joung JK.Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases.Nat Rev Genet.2016;17:300-312.
Gabriel R, Lombardo A, Arens A, et al.An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.Nat Biotechnol.2011;29:816-823.
Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, et al.GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.Nat Biotechnol.2015;33:187-197.
Chiarle R, Zhang Y, Frock RL, et al.Genome-wide translocation sequencing reveals mechanisms of chromosome breaks and rearrangements in B cells.Cell.2011;147:107-119.
Crosetto N, Mitra A, Silva MJ, et al.Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.Nat Methods.2013;10:361-365.
Kim D, Kim S, Kim S, Park J, Kim JS.Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome Res.2016;26:406-415.
Tsai SQ, Nguyen NT, Malagon-Lopez J, Topkar VV, Aryee MJ, Joung JK.CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.Nat Methods.2017;14:607-614.

次世代シーケンサーを用いてCRISPRゲノム編集を加速

NGSは、CRISPR-Cas9ゲノム編集実験全体にわたり研究者による完全な制御を可能にします。