次世代シーケンサーを用いてCRISPRゲノム編集を加速

NGSは、CRISPR-Cas9ゲノム編集実験全体にわたり研究者による完全な制御を可能にします。

CRISPRゲノム編集とNGS

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)ゲノム編集は、プログラム可能なRNAがヌクレアーゼ(Cas9など)にゲノムの特定の位置を標的とさせる革新的手法です。1,2 CRISPR-Cas9技術は迅速、シンプル、かつ精確に遺伝要素の変異、発現抑制、発現誘発、または置換を実現できるため、世界中の研究コミュニティにおいて広く取り入れられています。

CRISPRゲノム編集と次世代シーケンサーがもたらす情報のパワーとの統合により、研究者によるゲノム編集実験全体での完全な制御が可能になり、改変する生物系をより深く理解できるようになります。

ゲノム編集研究論文の概説

イルミナテクノロジーを利用した最新の遺伝子編集研究論文の概要。

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CRISPR-Cas9技術は、基礎研究、臨床研究、薬物療法、創薬、農業、および環境の分野で応用されていることが分かっています。臨床研究では、がん、AIDS、ハンチントン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの疾患においてCRISPRを利用できる可能性が示されています。

CRISPRゲノム編集により、研究者は遺伝子改変細胞株や動物モデルを迅速かつ精確に作製することができます。遺伝子ノックアウトの作製や特異性の高い改変の他にも、研究者はCRISPR技術によりゲノム配列を変化させずに阻害(CRISPRi)や活性化(CRISPRa)を介して遺伝子発現を調節することができます(表)。

CRISPRにより可能なゲノム編集の種類

CRISPRゲノム編集実験からは細胞集団が混じり合ったものが得られ、その中の小さなサブセットのみで目的の編集がされています。研究者は、どの細胞に目的のCRISPRノックアウトや標的変異があるのかを判断する必要があります。編集を評価する現行の手法には、切断アッセイ、PCR、サンガー法、およびNGSなどがあります(表)。

NGSは、全ての種類の改変にわたり高解像度で定性的情報も定量的情報も得ることができ、あらゆるスループットのニーズに対応でき、オフターゲット効果のモニタリングにも使用できる唯一の方法です。7 NGSを用いるターゲットシーケンスは、改変の標的領域に注目することでCRISPRによる編集を確認できるコスト効率の高いソリューションです。

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ゲノム編集のオンターゲット効果を確認する方法

CRISP/Cas9技術の実施を成功させるには、目的のターゲット以外の部位における意図しない改変であるオフターゲット効果を特定し、低減するストラテジーなどが必要となります。ゲノム編集実験では、RNAの特異性を評価し、オフターゲット部位を予測する計算法が広く使用されています。

オンラインツールやウェブベースのアルゴリズムが公開されています(表)。ただし、予測アルゴリズムでは見逃されるおそれのあるオフターゲット部位を発見するには、NGSによる全ゲノムシーケンス(WGS)などの全ゲノム解析が必要です。8

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オフターゲット効果を予測するための公開解析ツール

オフターゲット切断部位のスクリーニングのための全ゲノムアプローチには、細胞ベースアッセイとin vitroアッセイがあります(表)。

オフターゲット効果を解析するためのバイアスのない方法
シングルセルRNAシーケンス

CRISPR改変後に細胞集団をスクリーニングして、何千もの個々の細胞において同時に多数の遺伝子の遺伝子制御の影響を判定

RNAシーケンス

トランスクリプトーム全体または遺伝子/遺伝子ファミリーの発現に対する変異の影響を評価

ChIP-Seq

DNAとタンパク質の結合に対する変異の影響を判定

メチル化シーケンス

メチル化状態およびクロマチンリモデリングに対する変異の下流影響を調査

オンターゲットやオフターゲットの高解像度評価やCRISPRノックアウトや編集の機能に関する検証や評価の他にも、NGSはCRISPRゲノム編集ワークフローの別の段階に取り入れることができます。

初期設計段階において、(リファレンスゲノムのない種の)座位またはゲノムのリシーケンスはRNAの選択に役立ちます。CRISPR-Cas9とガイドRNAコンストラクトのクローニングプロセス中、得られたプラスミドをリシーケンスすることで、特に大きなプラスミドライブラリーのあるハイスループット実験の場合、CRISPR導入ベクターを迅速かつ高い信頼度で検証できます。

NGSはCRISPRゲノム編集ワークフローにこのように取り入れられます
ゲノム編集ポッドキャスト – CRISPR-Cas9とその先

イルミナのゲノムポッドキャストエピソード32では、コロンビア大学Biochemistry and Molecular Biophysics助教であるSam Sternberg博士が生物学およびCRISPRとゲノム編集の影響についてお話します。

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ゲノム編集ポッドキャスト – CRISPR-Cas9とその先
アグリゲノム
アグリゲノム

シンプルかつ低コストのCRISPR-Cas9技術は、作物における遺伝子編集を多数の汎用種から農学的に重要な多種多様な種にまで広げることができます。

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がん研究
がん研究

迅速かつシンプルなCRISPR-Cas9技術により、新たながんモデルの開発および免疫療法の新しい標的やストラテジーの発見が可能になります。

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複雑な疾患ゲノミクス
複雑な疾患ゲノミクス

精確なCRISPR-Cas9ゲノム編集により、疾患病理を調べるためにヒトの複雑な疾患の細胞モデルや動物モデルを開発することが可能になります。

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細胞分子生物学研究
細胞分子生物学研究

迅速、シンプル、かつ低コストのCRISPR-Cas9ゲノム編集は、遺伝子ノックアウトやトランスジェニックモデルの開発における細胞分子生物学に革命をもたらしました。

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CRISPR-Cas9:シンプルになったゲノム編集技術
CRISPR-Cas9:シンプルになったゲノム編集技術

このSciMonビデオでは、Scientific AffairsチームがCRISPR-Cas9技術を応用した最近の論文についてお話します。

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ターゲットリシーケンスと体細胞モザイク
ターゲットリシーケンスと体細胞モザイク

このカスタマーインタビューでは、遺伝学者が体細胞モザイク研究におけるNGSの使用と、CRISPR技術応用の将来的な可能性についてお話しします。

インタビューを読む
参考文献
  1. Cong L, Ran F A, Cox D, et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science.2013;339:819-823.
  2. Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al.RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013;339:823-826.
  3. Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, Bilate AM, Ingram JR, Ploegh HL.Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining.Nat Biotechnol.2015;33:538-542.
  4. Chu VT, Weber T, Wefers B, et al.Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells.Nat Biotechnol.2015;33:543-548.
  5. Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, et al.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.Cell.2013;152:1173-1183.
  6. Cheng AW, Wang H, Yang H, et al.Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.Cell Res.2013;23:1163-1171.
  7. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Nat Protoc.2013;8:2281-2308.
  8. Tsai SQ, Joung JK.Defining and improving the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 nucleases.Nat Rev Genet.2016;17:300-312.
  9. Gabriel R, Lombardo A, Arens A, et al.An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.Nat Biotechnol.2011;29:816-823.
  10. Tsai SQ, Zheng Z, Nguyen NT, et al.GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases.Nat Biotechnol.2015;33:187-197.
  11. Chiarle R, Zhang Y, Frock RL, et al.Genome-wide translocation sequencing reveals mechanisms of chromosome breaks and rearrangements in B cells.Cell.2011;147:107-119.
  12. Crosetto N, Mitra A, Silva MJ, et al.Nucleotide-resolution DNA double-strand break mapping by next-generation sequencing.Nat Methods.2013;10:361-365.
  13. Kim D, Kim S, Kim S, Park J, Kim JS.Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq. Genome Res.2016;26:406-415.
  14. Tsai SQ, Nguyen NT, Malagon-Lopez J, Topkar VV, Aryee MJ, Joung JK.CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.Nat Methods.2017;14:607-614.