非侵襲的な健康モニタリングのためのcfRNAの利点
循環セルフリーRNA（cfRNA、C-RNAとも呼ばれる）は、非侵襲的な健康評価の有望な代替手段です。DNAとは異なり、細胞のRNAトランスクリプトームは動的で組織固有です。cfRNAは、アポトーシス、微小胞排出、エクソソームシグナル伝達の細胞プロセスを介して、さまざまな組織によって循環に放出されます。cfRNAも安定しており、ヌクレアーゼによる分解から保護する小胞内に含まれています。cfRNA測定は、その多様な起源のため、遺伝子発現、細胞間シグナル伝達、および身体のさまざまな組織内で発生する細胞死の程度における組織特異的な変化を反映しています（図1）。5-9
図1： 循環血中cfRNAは標準的な採血から得られ、すべての体組織における分子変化を反映しています。
cfRNAライブラリー調製とシーケンスに最適化されたプロトコール
cfRNAは情報を得る可能性は高いものの、実際的な課題があります。1ミリリットルの血漿から得られるcfRNAはわずか数ナノグラムで、これは全長RNAと断片化RNAの混合物です。ヒトの血液中に存在するトランスクリプトの中で最も多いのはリボソームRNA（rRNA）とグロブリンRNAであり、これはより有益なトランスクリプトのシグナルを過剰に強化する可能性があります。これらの問題に対処するために、イルミナの研究チームは、cfRNAの低収率で部分的に断片化された性質に対応したワークフローを開発しました。標準的な枯渇法を用いてrRNAを除去するのではなく、すべてのcfRNAからライブラリーを作製し、ヒトエクソーム全体を対象としたプローブ支援濃縮を実施しました。
cfRNAシーケンスに最適化されたワークフローは、エクソンcfRNAシグナルを最大化し、低インプットサンプルのリスク失敗を最小限に抑え、室温での血液サンプルの翌日配送に対応しています。当初のプロトコールでは、ライゲーションベースのライブラリー調製を使用して、高品質の全トランスクリプトームcfRNAシーケンスデータを生成しました。1さらなる開発努力により、タグメンテーションベースのRNAライブラリー調製キットは、次の研究の波のためにさらに高い感度とスループットを可能にすることが示されました（図2、図3）。10
図2。Illumina RNA Prep with Enrichmentは、ライゲーションベースのプロトコールよりも多くの循環転写産物を検出する感度を高めます。
図3. イルミナRNA Prep with Enrichmentは、ライゲーションベースのプロトコールに比べて、少量のcfRNA転写産物のノイズが低減しています。
早発性子癇前症におけるcfRNAシグネチャーを同定するための概念実証研究
当社の最近のScience Translational Medicineの論文では、危険な妊娠合併症の妊娠高血圧腎症に関連するcfRNAの変化を特定するための概念実証研究でこのワークフローを確立し、適用する方法について説明しています。1チームは、重度の早発性妊娠高血圧腎症の女性から40名、健康な妊娠の女性から73名を含む113の血液サンプルを収集しました。
時としてノイズの多いデータの傾向を明らかにするために適応された機械学習の支援を受けて、多様な体組織の機能不全を捉え、独立したコホート全体で子癇前症の状態を正確に分類するcfRNAシグネチャを発見しました。循環血液中の30の転写産物は、合併症のない妊娠と比較して、差異的に豊富であることが確認されました。これらの転写産物には、胎盤機能不全、胎児発達障害、妊娠高血圧腎症の母体の免疫および心血管系の調節不全の特徴と一致する遺伝子腫瘍学のアノテーションと組織発現パターンがありました。（表1）。
妊娠高血圧腎症に関連する特定された循環転写産物のハイライト
妊娠高血圧腎症患者で観察されたcfRNAの変化は、この疾患の生物学と一致し、このアプローチの妥当性を裏付けました。同定された30種の遺伝子転写産物のうち、半数以上が子癇前症と関連していた（表1）。11-29 cfRNA転写産物の変化は、母体、胎盤、胎児の組織からの寄与を表す複数の異なる器官系からの情報を捕捉した。例えば、胎盤の機能不全や母親の血圧調節の変化を特定しました。
以下の遺伝子カテゴリーは、cfRNAによって捕捉された生物学的プロセスの障害の具体例を示しています。
IGFシグナル伝達：胎児の成長と発達の障害
子癇前症は、胎児の成長と発達の主要な制御因子である、生物学的に利用可能なインスリン様成長因子（IGF）の低値と関連しています。30-32 IGFBP5、PAPPA2、HTRA4、およびPRG2はすべてIGFシグナル伝達の制御に関連し、早発子癇前症の被験者では増加することが分かっています。
妊娠期間：早産のリスク
CRH、ZEB1、PNMT、妊娠期間と分娩開始に関連する遺伝子、33～35はプレクラムプスcfRNAで上方制御されました。早産は早発性子癇前症の一般的な転帰であり、本研究の影響を受けたほぼすべての参加者は早産でした。
血管新生：胎盤発達障害
この研究で同定された10の転写産物は、血管新生制御に重要です。APOLD1、LEP、SEMA3G、ADAMTS1、TIMP3、ADAMTS2、HTRA4、HSPA12B、SLC9A3R2、およびTIMP4。血管新生は、妊娠期間を通して適切な胎盤形成に不可欠な要素ですが、プレクラメプス妊娠では障害されます。36,37
血圧調節：高血圧
高血圧は子癇前症の明確な症状です。血圧調節に関連する複数の転写産物、ALOX15B、PNMT、ARHGEF25、APOLD1、およびCRHは、このコホートでcfRNA転写産物のレベルの上昇を示しました。
樹状細胞活性：妊娠免疫寛容障害
免疫系樹状細胞マーカーも子癇前症患者において異常な発現を示しました：CLEC4C、PLD4、TIMP3、VSIG4。樹状細胞は、妊娠中の胎盤および胎児の免疫系の寛容性において重要な役割を果たしており、子癇前症の背景にある潜在的な要因として関与しています。38-40
| 遺伝子記号 | 妊娠高血圧腎症の倍数変化 | タンパク質機能 |
|---|---|---|
胎児組織の発現 |
||
IGFBP5* |
+3.6 |
IGFシグナル伝達 |
ALOX15B * |
+5.7 |
血圧調節 |
NES * |
+4.5 |
胎児発生 |
TEAD4 |
+3.3 |
細胞増殖 |
PITPNM3 |
+3.2 |
細胞増殖 |
CUX2 |
-3.3 |
細胞増殖 |
FAM107A |
+5.0 |
細胞の増殖と遊走 |
PRX * |
+3.8 |
細胞構造 |
AMPH |
+5.0 |
エンドサイトーシス |
胎盤組織の発現 |
||
PAPPA2* |
+4.9 |
IGFシグナル伝達 |
HTRA4* |
+3.9 |
IGFシグナル伝達、血管新生 |
LEP * |
+10.7 |
血管新生 |
SEMA3G |
+3.5 |
血管新生 |
APOLD1* |
+3.4 |
血管新生、血圧調節 |
VSIG4* |
+8.1 |
樹状細胞の活性 |
胎盤/胎児組織の発現 |
||
PRG2* |
+5.2 |
IGFシグナル伝達 |
CRH * |
+5.7 |
妊娠期間、血圧調節 |
ADAMTS1* |
+3.5 |
血管新生 |
ADAMTS2 |
+11.6 |
血管新生 |
TIMP3* |
+4.1 |
血管新生、樹状細胞活性 |
その他の組織発現 |
||
PNMT |
+3.8 |
妊娠期間、血圧調節 |
ZEB1* |
+2.8 |
妊娠期間、血圧調節 |
TIMP4* |
+4.3 |
血管新生 |
SLC9A3R2 |
+3.6 |
血管新生 |
HSPA12B |
+3.5 |
血管新生 |
ARHGEF25 |
+4.1 |
血圧調節 |
PLD4 |
-3.0 |
樹状細胞の活性 |
CLEC4C * |
-3.6 |
樹状細胞の活性 |
DAAM2* |
+5.6 |
細胞増殖 |
KRT5* |
-5.8 |
細胞構造 |
* 子癇前症に関連する遺伝子 11-29
複雑な疾患の非侵襲的なバイオマーカーの発見と診断
我々の研究結果は、シーケンスcfRNAが血液中の子癇前症の分子シグナルを検出し、母体、胎児、胎盤の機能をリアルタイムでモニタリングする方法を示しています。この研究は、血液中の安定的な疾患シグネチャーの存在を示す概念実証でした。診断時に患者からサンプルが採取されたため、症状はすでに現れていました。しかし、子癇前症を示すcfRNA転写産物は、症状発現前に存在している可能性があり、バイオマーカーの予測的発見の可能性を特徴付けるためにさらなる研究が必要です。妊娠初期の子癇前症のこの検出モデルとスクリーニングは、妊娠合併症を発症するリスクが高い女性を同定し、早期介入を可能にする可能性があります。41
この研究では、非侵襲的で包括的な健康分子モニタリングのための研究およびバイオマーカー発見ツールとしてのcfRNAの幅広い可能性を強調しています。cfRNAシーケンスに最適化されたプロトコールにより、循環転写産物の確実な検出が可能になり、疾患に関連する再現性のある生物学的に関連性のある変化を同定できます。より多くの研究者が、アルツハイマー病、がん、およびその他の複雑な疾患の診断とサーベイランスのためのアクセス可能でユニークなバイオマーカーとして、循環RNAシグネチャの有用性を評価しています。42-46 この技術をさらに応用することで、多くの疾患の理解、診断、治療を変革することができます。
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アプリケーションノート：循環転写産物の検出の向上
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