イルミナ5塩基ソリューションの紹介

はじめに

DNA分子には、遺伝子配列やエピジェネティックな修飾など、複数の情報層が含まれており、本質的にマルチオミクス的です。4つのカノニカルヌクレオチドに加えて、5番目の塩基であるメチル化シトシンがあります（図1）。メチル化シトシンはエピジェネティックタグで、環境因子、発達因子、細胞因子に反応して遺伝子発現を修飾する動的な分子シグナルとして機能します。遺伝的バリアントが健康状態に関する洞察を提供するのと同様に、メチル化シグネチャの異常は疾患の指標となる可能性があります。遺伝情報とエピジェネティック情報をまとめることで、単一オミクス研究のみと比較して解像度と感度を高め、新しい生物学的洞察を明らかにすることができます。

バイサルファイトやEM-seqなどの市販のメチル化プロファイリング法は、非メチル化シトシンをチミンに変換し、ライブラリーからシトシンの大部分を除去し、シーケンスやアライメントが難しい低複雑性ゲノムを生成します。その後、メチル化されたシトシンは残りの未変換シトシンから推測されます。これらの技術は、DNAメチル化に関する現在の理解を形成するための基本的なツールでしたが、高解像度の遺伝子バリアントコーリングも可能にするのに十分な精度がありません。同じワークフローから両方のバリアントタイプを検出するソリューションが発見を大幅に加速すると想定しました。

その文脈において、代替アプローチに比べて高速、シンプルかつ包括的なワークフローでメチル化プロファイリングと遺伝子バリアントコーリングを可能にする革新的な5塩基ソリューションを導入します（図2）。

新しいソリューション

イルミナ5塩基ソリューションの中核となるのは、イルミナ社内でメチル化シトシンをシーケンサー対応チミンに選択的かつ直接変換するために設計された、新しいカスタム化酵素です（図3）。何百万ものタンパク質バリアントを反復世代にわたってスクリーニングし、メチル化シトシンに対する選択性と効率が最も高いタンパク質を同定し、反応がわずか30分で最適に機能するようにしました。

5塩基ソリューションの基礎となるのは、メチル化を考慮したゲノムアライメント、メチル化定量化、および高精度バリアントコーリングを1回の解析で実行する、高度に最適化されたイルミナのDRAGENアルゴリズムです。このソフトウェアの根本的なイノベーションは、補完的なDNA鎖にコードされた情報を活用して、メチル化変換シトシンをC>T 1塩基変異（SNV）と区別する能力です。メチル化シトシンの場合、パイプラインは相補的塩基をグアニンと想定していますが、C>Tバリアントの場合、相補的塩基はアデノシンです（図4）。個々のシトシン位置におけるメチル化レベルとバリアントアリル頻度（VAF）は、両方の鎖をカバーするリードに含まれる情報から推測されます。

仕組み

メチルシトシン変換反応は、高効率ライゲーションベースのライブラリー調製ワークフロー内のシンプルで統合されたステップです。ワークフローは、抽出され、せん断されたgenomic DNA（gDNA）またはセルフリーDNA（cfDNA）から始まり、その後、突出末端の平滑化/末端平滑化、Aテーリング、アダプターライゲーションが行われます。次に、DNAを変性し、5-メチルシトシン変換酵素とインキュベートして、メチル化シトシンを1時間以内に1回の反応で直接変換します。変換後、サンプルはPCRにより増幅され、標準的なイルミナシーケンスプラットフォームでのシーケンスのためにビーズ精製されます。ライブラリー調製は高度に合理化されており、8時間以内に完了できます。変換ケミストリーは、UMIベースのエラー補正を含む、詳細なアプリケーションのためのターゲットキャプチャーエンリッチメントとも互換性があります。

シーケンスが完了すると、アライメント、メチル化アノテーション、およびバリアントコーリングを、1回のプッシュボタン式解析パイプラインでわずか1時間で実行できます。結果は、Illumina Connected MultiomicsやEmedgeneなどの解釈ソフトウェアでさらに処理できます。

少ないシーケンスで高精度のメチル化プロファイリング

ベンチマーキング研究では、5塩基ソリューションは、ゴールドスタンダードのメチル化変換法と同等の精度でメチル化プロファイリングを提供します。このケミストリーは、メチル化および非メチル化pUCおよびラムダコントロールゲノムを用いた評価に基づいて、メチル化シトシンの高い変換率と非メチル化シトシンの非常に低いオフターゲット変換を達成します（図6A）。ヒトゲノムのCpGアイランドにわたる5塩基ソリューションで測定されたメチル化レベルは、EM-seq変換から得られた値と著しく一致しています。メチル化シトシンのみを変換する5塩基ライブラリーの高いマッピング性により、シーケンス深度ごとにカバーされるCpG部位が増え（図6C）、5塩基ソリューションでより高い検出力が得られます。 

高感度で遺伝的バリアントを同時に検出

非メチル化シトシンをチミンに変換するメチル化ケミストリーは、遺伝的バリアントの検出に課題をもたらし、通常、遺伝的バリアント情報が必要な場合は、標準的なシーケンスライブラリーを別々に処理する必要があります。イルミナ5塩基ソリューションは、同じシーケンスリード内のメチル化シトシン検出に加えて、4つの塩基位置（A、T、G、C）すべてで高解像度のバリアント検出を可能にすることで、2つのライブラリー調製を別々に行う必要性を排除します。イルミナBaseSpace Sequencing HubまたはIllumina Connected Analyticsで利用可能なDRAGENアプリケーションで解析すると、5塩基ソリューションは生殖系列バリアントと体細胞バリアントの両方に対して高精度の小規模なバリアントコーリングを提供します（図7A, 7B）。さらに、このテクノロジーをターゲットキャプチャーエンリッチメントと組み合わせることで、血液、新鮮凍結組織、またはcfDNAからの低頻度バリアントを検出することができます（図7B）。

デュアルオミクス洞察による1つのアッセイで発見を強化します。

イルミナ5塩基ソリューションは、1つのワークフローから遺伝学およびエピジェネティックな洞察を活用するための新しいアプローチであり、がんや希少疾患を含む幅広い研究アプリケーションで発見力を高めると予測されます。1回のリードでゲノムとメチロームの状態を同時に報告することで、病原性変異と生殖系列のアリル特異的メチル化を関連付けることができます（図8A）。また、5塩基は、単一サンプル調製から得られたゲノムおよびメチル化シグネチャのデュアルオミクス解析によってケースを解決することを証明しています（図8B）。イルミナでは、デュアルオミクスの洞察を組み合わせることで、幅広いエキサイティングなアプリケーションにおいて、どのように新しい発見をもたらすかを探り続けています。この5塩基ソリューションは2026年初頭に市販される予定です。