HiTS-RAP
HiTS-RAP
HiTS-RAPは、RNAアプタマーとタンパク質との結合相互作用を大規模に評価する定量的手法です。HiTS-RAPは、フローセル上でDNAを直接転写し、RNAアプタマーと蛍光標識タンパク質との結合親和性を測定します。
まず、シーケンスライブラリーを調製し、イルミナフローセルでシーケンスします。次に、DNAの2番目の鎖が取り除かれ、フローセルに付着した一本鎖DNAが32 bp Terシーケンスを含むプライマーにアニーリングされます。大腸菌複製ターミネータータンパク質（Tus）がシステムに導入され、Terシーケンスに結合します。T7 RNAポリメラーゼによるRNA転写は、Tus結合Ter部位の上流で開始および停止します。RNAポリメラーゼ活性は、DNAに結合したTusにより突然停止したため、RNA鎖はRNAポリメラーゼ複合体に依然として連結しています。蛍光標識タンパク質が導入され、曝露されたRNAアプタマーに結合して、シーケンサーが読み取ることができる蛍光シグナルを生成します。
同様の方法：RBNS、RNA-MaP。
長所：
- RNAアプタマーの結合親和性を大規模並列スケールで定量的に評価します。
- 非タンパク質分子に容易に適応可能
- RBPのde novo結合特異性を判定できる
短所：
- ペアエンドシーケンスプロトコールが使用されない限り、150 nt以下のRNA断片の解析に限定され、限界は500 ntに増加します
- オン/オフレートなどの結合動態を測定できない
- 通常、大きなタンパク質に存在する立体障害作用に感受性
- HiTS-RAP：Tome J. M., Ozer A., Pagano J. M., Gheba D., Schroth G. P., et al. （2014）ハイスループットシーケンスによるRNA-タンパク質相互作用の包括的な解析-RNAアフィニティプロファイリング。ネイティブメソッド11：683-688
- HiTS-RAPプロトコール：Ozer A., Tome J. M., Friedman R. C., Gheba D., Schroth G. P., et al. （2015）ハイスループットシーケンスとRNAアフィニティプロファイリングによるRNA-タンパク質相互作用の定量的評価。Nat Protoc 10：1212-1233