NET-Seq
mNET-Seq
mNET-Seqは、全ゲノムのさまざまなC末端ドメイン（CTD）リン酸化状態に関連する初期のRNAおよび転写RNAプロセッシングのプロファイルを生成します。mNET-Seqは、転写産物の伸長中にRNAPII活性部位の正確なシーケンスリード、およびRNAプロセッシング中間体を提供することができます。まず、伸長するRNAPII複合体をクロマチン分画によって単離します。これらはMNaseで消化され、RNAPIIまたはスプライセオソームで保護されたRNA鎖をそのまま残しながら、露出したすべてのDNAを分解します。RNAPII複合体は、RNAPII抗体を使用して免疫沈降され、T4 PNKによって5'リン酸化されます。次に、3'リンカーは、RNAPII内にまだ埋め込まれているRNA鎖の3'ヒドロキシル末端にライゲーションされます。また、サイズ選択を容易にするために放射性ATPと共にインキュベートされます。Nascent RNA鎖は、35～100 ntのサイズで選択され、cDNAシーケンスライブラリーに処理され、シーケンスされます。精製中にさまざまなRNAPII抗体を使用することで、RNAPIIのCTDをターゲットにした手法の汎用性と特異性が向上します。
長所：
- リン酸化CTDによるRNAPII伸長中に、新生RNA鎖と転写RNA処理をマッピング
- TSS 1でセンス転写産物とアンチセンス転写産物を検出できる
- クロスリンクなし：アーチファクトによる相互作用の発生をなくします
- MNase消化は特異的で効率的
- さまざまなRNAPII特異的抗体を使用して、ターゲット精度を向上させることができます
短所：
- 35 nt未満のナセントRNAは確実に検出できない
- RNAPII免疫沈降中にRNAが分解する可能性があります
- mNET-Seqピークは、転写RNA切断からのピークによって不明瞭になる可能性があります
- PCR増幅は、増幅バイアスからピークを生じる可能性があります。