PIP-Seq
PIP-Seq
PIP-Seqは、架橋細胞または非架橋細胞における未処理RNA種と成熟RNA種の両方でRBP相互作用部位をシーケンスします。PIP-seqでは、RNase感受性断片とRNase非感受性断片の両方を分離し、別々に処理して、どのシーケンスが実際にRBPに結合し、どのシーケンスがRNaseに非感受性であるかを区別します。
まず、架橋細胞（紫外線またはホルムアルデヒドによる）または非架橋細胞を溶解します。ライセートは、実験的コントロールとRNase不感受性コントロールの2つのバッチに分けられます。実験サンプル/フットプリントサンプルは、二本鎖RNase（dsRNase）または一本鎖RNase（ssRNase）で消化され、その後プロテイナーゼKで処理されてRBPが除去されます。しかし、RNaseに反応しない領域をスクリーニングするために、まずコントロールをプロテイナーゼKで処理し、次にssRNaseまたはdsRNaseで処理します。両方の断片セットは逆架橋されており、鎖特異的ライブラリーの調製に使用されます。各ライブラリーは、再ハイブリダイゼーションと熱安定性二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いてノーマライズされ、シーケンスされます。
長所：
- 未処理または成熟RNAのRBPに結合したRNA領域のシーケンス
- RNaseに反応しない領域を同定
- 組織および生物全体に使用可能
- ストランド固有
短所：
- 小さなヌクレオチドの隆起とループの解像度が限られている1
- ホルムアルデヒド架橋は、タンパク質とRNAの結合に加えて、タンパク質とタンパク質の結合のリスクを示します1
- ヌクレアーゼは植物細胞への拡散性が限られており、硫酸ジメチル（DMS）などの化学プローブの利点があります1
- PIP-Seq：Silverman I. M., Li F., Alexander A., Goff L., Trapnell C., et al. （2014）RNaseを介したタンパク質フットプリントシーケンスにより、ヒトトランスクリプトーム全体のタンパク質結合部位が明らかになります。ゲノム生物学15：R3
- PIP-Seq：Silverman I. M. and Gregory B. D. (2014) Transcriptome-wide ribonuclease-mediated protein footprintingによりRNA-タンパク質相互作用部位を同定。手法
- 1. Foley S. W., Vandivier L. E., Kuksa P. P. and Gregory B. D. (2015) 植物RNA二次構造の全トランスクリプトーム測定。Curr Opin Plant Biol 27：36-43
- Anderson S. J.、Willmann M. R.、およびGregory B. D. Protein Interaction Profile Sequencing（PIP-seq）を植物に導入しました。植物生物学における現在のプロトコール。2016年
- Nussbacher J. K.、Batra R.、Lagier-Tourenne C.、Yeo G. W.の神経変性におけるRNA結合タンパク質：Seqとあなたは受け取ります。Trends Neurosci。2015;38:226-236
- Foley S. W.、Vandivier L. E.、Kuksa P. P.、およびGregory B. D. Transcriptomeによる植物RNA二次構造の測定。Curr Opin Plant Biol. 2015;27:36-43
- Popova V. V.、Kurshakova M. M.およびKopytova D. V. [RNA-タンパク質相互作用の研究方法〕。Mol Biol（モスク）。2015;49:472-481