NET-Seq
シェイプ-MaP
SHAPE-MaPは、超並列スケールでさまざまなレベルで二次RNA構造をシーケンスします。本メソッドは、RNAの混合物中の小さなRNA、アンプリコン、または希少なRNA種を正確に調べるためにカスタマイズすることができます。名前に示されているように、SHAPE-MapはSHAPE-Seq 1M7反応を使用してRNAリボース2’-OH基をマークし、二次RNA構造を同定します。この反応の後、変異プロファイリング（MaP）を行い、RT中にSHAP付加体に非相補的なヌクレオチド変異を誘導します。これらのMaP変異は、この手法のために特別に開発された強力なインフォマティクスツールを使用してシーケンス後に解析されます。
簡潔に述べると、折り畳まれたRNAを含むサンプルにSHAP求電子試薬が添加されます。サンプルは、逆転写による内因性バックグラウンド変異率を補正するために、＋試薬、–試薬、変性コントロールの3つの異なる反応ラインに分けられます。SHAPE変異が導入された後、目的のRNAタイプ（アンプリコン、低分子RNA、または特定のRNA種のプロファイリング）に応じてRTプライマーが選択されます。プライマーを反応に添加し、RNAを逆転写します。その後のライブラリー調製ステップは、目的のRNAによって異なります。低分子RNAのワークフローには、適切なプライマーを用いた標準的なPCR増幅が含まれます。アンプリコンと特定のRNA種のワークフローは、Nextera XT DNA Library Preparation Kitプロトコールに従います。バーコード化されたサンプルはシーケンスの準備ができました。
同様の方法：SHAPE-Seq、icSHAPe
長所：
- SHAPE-SeqとMaP技術を組み合わせて、単一ヌクレオチドの分解能でRNA構造を同定
- ライブラリー調製ステップは、アンプリコン、低分子RNA、希少RNA種のプロファイリングなど、さまざまなアプリケーション向けに高度にカスタマイズできます
- アダプターライゲーション法で遭遇する一般的な問題を回避
短所：
- RNA鎖の長さは、ランダマーとネイティブワークフローでは約150 nt以上、スモールRNAワークフローでは約40 nt以上でなければなりません
- RNAレベルが低いサンプルでは、MaP変異をバックグラウンドノイズと区別することが困難
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