2b-RADはddRadseqに似ていますが、認識部位の上流と下流で切断するIIB型制限酵素(BsaXIまたはAlfI)を使用します。これにより、ターゲットゲノムは33 bp(BsaXI)または36 bp(Alfl)の一定長の多数のDNA断片に断片化されます。これらの短いDNA断片をシーケンスして、遺伝的バリアントを決定することができます。
この方法では、ゲノムDNAはまず制限酵素(BsaXI)で消化され、部分的(NNN)オーバーハングを持つアダプターが断片にライゲーションされます。異なるサンプルからのアダプターライゲーション断片が組み合わされ、断片が増幅されます。