5'-GRO-Seq
5'-GRO-Seq
5'-GRO-Seqは、標識ヌクレオチドを使用して、任意の時点で7-メチルグアニル酸（m7G）キャップで新生RNAのシーケンスをマッピングします。この手法は当初、エンハンサーRNAの存在によるTSSの不安定性をマッピングして検出するために開発されました。
GRO-seqと同様に、5'-GRO-Seqは、溶解した核物質にBr-UTPとサルコシルを添加することから始まります。Br-UTPはRNAを単離するためのマーカーとして機能し、サルコシルはDNAへの追加のRNAPIIの結合を阻害します。反応が停止した後、DNase Iを添加し、RNA産物を断片化します。RNAの3'末端はT4 PNKで脱リン酸化され、ブロモウリジンを含む断片は抗BrdU抗体で捕捉されます。単離されたRNAはCIPで脱リン酸化され、5'キャップはTAPを用いて除去されます。次に、RNAリガーゼ2とRNAリガーゼを用いて3'アダプターと5'アダプターをそれぞれライゲーションします。断片は逆転写され、得られたcDNAは単離および増幅され、cDNAは60～110 bpの断片に対してサイズ選択されます。断片はゲルから分離され、シーケンスされます。
長所：
- 任意の時点で5' RNAシーケンスにキャップを付けた初期のものをマッピング
- 転写部位の活性を判定
- 転写部位の事前知識は不要
短所：
- 標識ヌクレオチドとのインキュベーションにより、細胞培養およびその他の人工システムに限定