eCLIP
eCLIP
メソッドカテゴリー：トランスクリプトーム>RNA-タンパク質相互作用
説明：eCLIPは、修飾個別ヌクレオチド分解能CLIP（iCLIP）プロトコルを使用してターゲットRNA上のRBPの結合部位をマッピングし、効率を改善し、実行の複雑さを軽減します。この方法の特徴は、バーコード化された一本鎖DNAアダプターのライゲーションであり、増幅バイアスを大幅に低減します。
まず、RNAと目的のタンパク質がUV架橋され、続いて細胞溶解とRNase I消化が行われます。次に、タンパク質-RNA複合体を免疫沈降し、ターゲットRNAの3'末端にあるRNAアダプターにライゲーションします。結合したタンパク質はプロテイナーゼK消化によって除去され、RNAは逆転写されます。得られたcDNAは、N5またはN10シーケンスのいずれかを含む3'末端の一本鎖DNAアダプターにライゲーションされ、PCR重複に対する固有の識別子として機能します。最後に、ペアエンドcDNA断片を増幅し、シーケンスします。
同様の手法：iCLIP、irCLIP、HITS-CLIP。
長所：
- タンパク質-RNA結合部位のハイスループットマッピング
- バーコード化されたアダプターは、PCRの重複リードを大幅に削減し、スループットを向上させます
- ライゲーション効率が約1000倍向上
- 放射性マーカーの使用を避ける
短所：
- ターゲットに特異的な抗体は、非特異的な複合体を誘発します
- クロスリンクはすべてのRNA結合ドメインを網羅しているわけではありません1
関連出版物
- Marchese D., de Groot N. S., Lorenzo Gotor N., Livi C. M. and Tartaglia G. G. Advances in the characterization of RNA-binding proteins. Wiley Interdiscip Rev RNA。2016;7:793-810
- Bangru S.とKalsotra A.は、真核生物トランスクリプトームにおけるRNAの多様性解析の進歩：Omicsレンズを通したピアリング。F1000Research. 2016;5:2668
- Manning K. S. and Cooper T. A. 遺伝子型から表現型への翻訳におけるRNA処理の役割 Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18:102-114
- Sundararaman B., Zhan L., Blue S. M., et al. 機能性RNA要素の包括的な発見のためのリソース。モルセル。2016;61:903-913