FRISCR
FRISCR
FRISCRは、固定および染色された単一細胞からのトランスクリプトームプロファイルを特徴付けます。この方法では、分子バーコードとTn5タグメンテーションを組み合わせて、すべての細胞から各cDNA断片を一意に同定します。
細胞懸濁液はパラホルムアルデヒドで固定され、透過処理され、免疫染色されます。個々の細胞は、FACSによってチューブに分類されます。これらの細胞は溶解され、56°Cで1時間インキュベートすることにより逆架橋されます。細胞からのmRNAはdT25磁気ビーズプルダウンにより単離されます。mRNAシーケンスライブラリーは、Smart-seq2の手順に従って調製します。1）Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素によるRTのテンプレート切り替え、2）得られたcDNAのPCR増幅、3）cDNAライブラリーの作製にはNextera XT Library Preparation Kitを使用します。cDNA断片にはアダプターが隣接しており、シーケンスの準備が整います。
長所：
- 固定および染色された単一細胞からの完全長mRNAトランスクリプトームプロファイリング
- 免疫染色により、希少細胞集団のターゲット化が可能
- 完全長mRNAリードの生成
- Triton-X100溶解からの固定細胞と比較して、有意に多くのmRNAが回収されました
短所：
- 3'～5'バイアス
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Thomsen E. R., Mich J. K., Yao Z., Hodge R. D., Doyle A. M., et al. （2016年）ヒト放射状グリア多様性の固定単一細胞トランスクリプトーム特性評価。ネイティブメソッド13：87-93