irCLIP
irCLIP
irCLIPは、以前のCLIP法と比較して、より少ないサンプル材料、時間、およびcDNAライブラリー品質の向上を使用して、タンパク質とRNAの相互作用部位をマッピングします。irCLIPは、iCLIPとHITS-CLIPの両方で、逆転写酵素の停止や短いcDNAライブラリー断片などの問題に対処するために、オンビーズヌクレアーゼ消化を使用して設計されました。
まず、RNAタンパク質複合体はUV架橋され、免疫沈降されます。次に、RNase AとRNase Iを使用して消化し、タンパク質結合RNA鎖の両端を切除します。IR800-biotinアダプターは、RNA断片の3'末端にライゲーションされます。サイズ選択、ニトロセルロースブロッティング、およびプロテイナーゼK消化の後、目的のRNA鎖が精製されます。これらは逆転写され、再び免疫精製されます。cDNA鎖は循環化され、PCR増幅されてシーケンス用のcDNAライブラリーを生成します。
長所：
- 最小限の出発物質によるタンパク質-RNA相互作用の非同位体検出
- ビーズ上のヌクレアーゼ消化により、cDNAライブラリー調製用のRNA断片の長さが向上
- 小細胞サンプルに対応し、新しいRBP結合部位を明らかにすることができる
- 60°Cで熱安定性のある逆転写酵素を使用し、二次RNA構造を融解することでバイアスを低減1
短所：
- まだ科学界で広く採用されていない
- 循環ステップによりアーチファクトが生じる場合があります