PAL-Seq
PAL-Seq
PAL-Seqは、ビオチン化デオキシウリジン三リン酸（dUTP）に蛍光タグを組み込み、シグナル強度を使用してポリ（A）テール長を定量化することで、ポリ（A）テール長を測定します。3P-Seq RNAライブラリー調製と同様に、3'-アダプター配列を含むスプリントオリゴヌクレオチドはポリアデニル化RNAの3'末端にライゲーションされ、RNase T1で部分的に消化されます。
mRNAをトータルRNAから分離するために、サンプルはゲル精製によってサイズ選択され、アダプターライゲーションのために5'末端をリン酸化する前にストレプトアビジンビーズに結合されます。クラスター形成の前に、mRNA断片はcDNAに逆転写され、ビーズから放出され、ゲルによるサイズ選択によって精製されます。シーケンスプライマーはポリ（A）シーケンスの3'末端に付着し、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）とビオチン化dUTPを使用して伸長します。断片をマッピングするには、ポリ（A）テールの5'末端付近の領域をシーケンスします。蛍光標識ストレプトアビジン分子がビオチン-dUTPに付着し、そのシグナル強度を測定して、各クラスターのアデニンホモポリマーの長さを定量化します。
長所：
- 長さに関係なくポリ（A）テール長を正確に測定
- poly(A)テールの直接シーケンスを回避
短所：
- 技術的に複雑な作業
- ビオチン-dUTP延長ステップ中に効率に関する問題が発生する可能性があります
- アデニンのみで構成される3'末端のみをキャプチャ
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