RASL-Seq
RASL-Seq
次世代シーケンス（RASL-Seq）によるRNA媒介オリゴヌクレオチドのアニーリング、選択、ライゲーションは、数千の異なる条件下で数百の遺伝子の発現プロファイルを定量化する2次元RNAシーケンス方法です。
カスタムプローブペアは、関心のある各遺伝子用にデザインされています。1組のプローブには以下が含まれている必要があります。1）3'末端に共通インデックスプライマーと、5'末端にリン酸を持つターゲットエクソン配列に対応する20 ntオリゴヌクレオチドを含む1つのプローブ、および2）5'末端にP5アダプターを持つ別のプローブで、他のプローブに隣接するエクソンに相補的な20 ntの配列を持つもの。プローブペアをmRNAにハイブリダイズし、オリゴ（dT）-ビオチンビーズを用いてトータルRNAから分離します。ライゲーションステップは、プローブペアを単一のPCRアンプリコンプローブに結合します。その後、ビオチン化mRNA鎖をストレプトアビジン磁気ビーズに付着させ、プローブ断片を溶出します。次に、P7アダプターを3'インデックスプライマーにアタッチし、ライブラリーはシーケンス前にPCR増幅を受けます。ライブラリーは、40 ntのライゲーションP5プライマーからシーケンスした後、P7プライマーオリゴヌクレオチドからシーケンスします。
長所：
- 何千もの異なる実験条件下で、大規模な遺伝子パネルで遺伝子発現を定量化
- 低い総RNA量で有効（約1000細胞で10 ng）
- 単離されたRNAサンプルまたは細胞ライセートで実施可能
- カスタムロボットを使用して、手動または自動で実行できます
短所：
- シーケンスは短い40 ntの断片で行われ、反復領域で問題を引き起こす可能性があります
- RNAレベルが低いと、高いランダムライゲーション率が発生する可能性があります
- 自動化されたプロセスでは、プローブ除去中のランダムライゲーションにより、より頑健な結果が得られます
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