Smart-Seq/NanoCAGE/CAGEスキャン

Smart-Seq/NanoCAGE/CAGEスキャン

Smart-SeqおよびSmart-Seq2:Switch Mechanism at the 5' End of RNA Templates Smart-Seqは、転写産物全体のリードカバレッジが改善されたシングルセルシーケンスプロトコールとして開発されました。ゲノム全体の完全なカバレッジにより、代替転写アイソフォームとSNPの検出が可能になります。Smart-Seqには2つのバージョンがあります。Smart-SeqおよびSmart-seq2。Smart-seq2には、オリジナルのSmart-Seqプロトコルよりもいくつかの改善点があります。新しいプロトコールには、ロックド核酸(LNA)、MgCl2濃度の増加、ベタイン、および精製ステップの排除が含まれ、収率を大幅に改善します。

Smart-Seq:細胞を溶解し、RNAをオリゴ(dT)含有プライマーにハイブリダイズします。cDNAの最初の鎖は、数個の未温度のCヌクレオチドを添加することで合成されます。このポリ(C)オーバーハングは、全長転写産物にのみ添加されます。オリゴヌクレオチドプライマーをポリ(C)オーバーハングにハイブリダイズし、第2鎖の合成に使用します。全長cDNAをPCR増幅し、ナノグラム量のDNAを得ます。PCR産物はシーケンス用に精製されます。

長所:
  • mRNAシーケンスは必ずしも判明している必要はありません
  • わずか50 pgの出発物質を使用できます
  • 転写産物全体のカバレッジの向上
  • 高レベルのマッピング可能なリード
短所:
  • 鎖特異的ではない
  • 早期マルチプレックスなし
  • poly(A)+ RNAにのみ適用