TIF-Seq
TIF-Seq
Transcript isoform sequencing（TIF-Seq）は、5'capsおよびpoly(A)テールを持つ完全長mRNA分子の選択的シーケンスによって転写アイソフォームを同定します。キャップされたmRNA分子は、5'capsをオリゴヌクレオチドで置き換えることによって選択されます。この結果を得るために、キャップされていないRNAから5'-リン酸基を除去し、キャップされたRNAと区別します。キャップは、タバコ酸ピロホスファターゼ（TAP）処理によって除去され、オリゴヌクレオチドとのライゲーションのために5'-リン酸基が露出します。mRNAは2つの異なるチューブに分離され、逆転写されて全長cDNA（flcDNA）を生成します。各チューブのflcDNAはバーコード付き5'-ビオチン化プライマーと3'プライマーにアニーリングされます。プライマーには、キメラ断片および分子間ライゲーションに対する制御メカニズムとして、各チューブに固有のバーコードシーケンスが含まれています。2本のチューブを混合し、NotI酵素で消化して粘着性の末端を生成し、ライゲーションして円形の二本鎖cDNAを形成し、その後断片化します。ビオチン化3'末端および5'末端を含む断片をストレプトアビジンで単離します。マルチプレックスバーコードを精製したcDNA断片の3'および5'末端に添加して、シーケンス用のcDNAライブラリーを作成します。
長所：
- 同じRNA鎖の5'末端と3'末端をシーケンスして転写アイソフォームを同定
- キメラコントロールバーコードは、cDNA断片の分子間ライゲーションをフィルターで除去します
短所：
- サンプルに大量の全長RNAが必要
- NotI酵素を使用して粘着性のある末端を導入することは、酵母のようなATリッチゲノムに対してのみ実行可能です
- 短いRNA鎖に対する強いバイアス1
- Anamika K., Verma S., Jere A. and Desai A. 次世代シーケンスを用いたトランスクリプトームプロファイリング - 進歩、利点、課題。2016年
- Bagchi D. N. and Iyer V. R. The Determinants of Directionality in Transcriptional Initiation. Trends Genet. 2016;32:322-333
- Sole C., Nadal-Ribelles M., de Nadal E. and Posas F. ストレス適応中の細胞周期制御におけるlncRNAの新たな役割。Curr Genet。2015;61:299-308