ClickSeq
ClickSeq
ClickSeqは、ライブラリー調製ステップの断片化の代替としてバイオコンジュゲーションを使用し、標準的なシーケンス法よりも低いエラー率を実現するRNAシーケンス技術です。
まず、RNAはサンガーシーケンスと同様のプロセスで、3'-アジド-2',3'ジデオキシヌクレオチド（AzNTP）を用いてcDNAに逆転写されます。このプロセスは、RNAテンプレート上のランダムな位置をシーケンスするために、鎖末端プライマーとセミランダムプライマー（6つのランダムヌクレオチドに続いてIllumina 3' P7アダプター）を誘導します。一本鎖cDNAを精製し、3'末端をアルキン修飾（5'ヘキシニル）P5アダプターでクリックライゲーションします。PCR増幅後、cDNAライブラリーのシーケンスの準備が整いました。
長所：
- 断片化ステップの排除により、人工組み換え率が有意に減少
- 希少な組み換え事象の検出に非常に適しています
- 断片化ステップなし
短所：
- 3'-アジドブロックcDNA断片は、低効率で二本鎖DNAに変換されます
- AzNTPのリードスルーは依然として非常に非効率的です
- 単一細胞または単一分子研究にはさらなる最適化が必要