iCLIP
iCLIP
iCLIPは、HITS-CLIPおよびPAR-CLIPと同様のプロセスでタンパク質とRNAの相互作用をマッピングします。このアプローチには、架橋後にタンパク質を消化し、架橋部位を逆転写酵素でマッピングするための追加ステップが含まれます。
iCLIPでは、特定の架橋RNA-タンパク質複合体が免疫沈降されます。結合部位で架橋されたタンパク質は消化されないままであるため、複合体はプロテイナーゼKで処理されます。RT時に、cDNAは結合部位で切断され、環状化されます。これらの円形の断片は線形化され、PCR増幅されます。これらの増幅断片のディープシーケンスは、タンパク質結合部位のヌクレオチド分解能を提供します。eCLIPは、アーチファクトを減らすためにcDNAの循環を回避するiCLIPよりも改善されています。
その他のバージョン：HITS-CLIP、PAR-CLIP、eCLIP、irCLIP。
長所：
- タンパク質結合部位のヌクレオチド分解能
- ヌクレアーゼの使用を避ける
- 増幅により、まれなイベントの検出が可能
短所：
- ターゲットに特異的な抗体は、非特異的な複合体を誘発します
- 非線形PCR増幅は、再現性に影響を与えるバイアスにつながる可能性があります
- サーキュライゼーションステップではアーチファクトが発生する場合があります
- UV架橋タンパク質-RNA複合体の可視化に必要な放射性同位体は、5'末端のみを標識します
- 円形結紮は非効率的である可能性がある
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