miCLIP-m6A
miCLIP-m6A *
miCLIP-m6Aは、トランスクリプトーム内のm6Aの位置を単一ヌクレオチド分解能でマッピングします。この方法では、anti-m6A抗体はmRNAシーケンスに架橋され、cDNAライブラリーが調製され、シーケンスされます。miCLIPにおけるcDNAライブラリー調製は、iCLIPプロトコールに厳密に従います。
トータルRNAから始めて、mRNA鎖を分離し断片化します。Anti-m6A抗体が導入され、UV架橋されます。RNA抗体複合体は免疫沈降され、精製されます。iCLIP cDNAライブラリー調製プロトコールに従い、RNAの3'末端は脱リン酸化され、3'アダプターにライゲーションされます。RNA複合体は、結合anti-m6A抗体をプロテイナーゼKで消化する前に再度精製されます。遊離RNA鎖は逆転写され、結果として生じるcDNA鎖は、シーケンス前に循環化、再線化、PCR増幅されます。m6A残基は、RNA上のペプチド残基からcDNA切断とシトシンからチミンへの置換パターンを解析することで正確に同定されます
長所：
- m6Aを単一ヌクレオチドの分解能でトランスクリプトーム全体にマッピング
- 低分子RNA種のm6Aを同定
- m6Amに加えてm6Amも同定可能
- PAR-CLIPのように、4-SUによる細胞の前処理は関与しません
短所：
- C-to-T置換パターンの産生に使用される抗体の一貫性に依存
- cDNAライブラリー調製では放射性標識を使用します