PAR-CLIP
Par-CLIP
PAR-CLIPは、ターゲットRNA上のRBP部位をマッピングします。このアプローチは、HITS-CLIPやCLIP-Seqに似ていますが、タンパク質-RNA複合体を安定化するために、はるかに効率的な架橋を使用します。光活性化リボヌクレオシドを導入する要件により、細胞培養とin vitroシステムへのこのアプローチが制限されています。
この方法では、4-SUおよび6-チオグアノシン（6-SG）が培養細胞の転写産物に組み込まれます。UV照射は、4-SU /6-SG標識転写産物を相互作用するRBPに架橋します。ターゲット複合体は、RNA抽出前にRNase T1で免疫沈降および消化され、その後にプロテイナーゼKが続きます。RNAはcDNAに逆転写され、シーケンスされます。cDNAのディープシーケンスは、標識転写産物と相互作用するRBPを正確にマッピングします。
長所：
- RNA-タンパク質相互作用の高精度マッピング
- 4-SU /6-SGを用いたラベリングにより架橋効率を向上
- 合法的な架橋配列は変異塩基の存在に基づいて同定でき、ミスプライミングはバイオインフォマティクスでフィルタリングできます1
短所：
- 標的に特異的な抗体が非特異的な複合体を惹起することがある
- 細胞培養およびin vitroシステムに限定
- 光反応性ヌクレオシドは細胞傷害性である可能性があります2
- 高濃度の4-SUはrRNA合成を阻害し、核小体ストレス応答を誘導します3
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