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NGSワークフローのステップ

次世代シーケンスの主なステップ

次世代シーケンスのワークフローは3つの基本的なステップ(ライブラリー調製、シーケンス、データ解析)で構成されます。各ステップの基礎を学び、NGSワークフローの計画をどのように立てるかをご確認ください。

ワークフローの例はこちら

NGSワークフローの準備

次世代シーケンスワークフローを始める前に、核酸を分離して精製します。一部のDNA抽出法では阻害剤を加えることがありますが、阻害剤はNGSワークフローで行う酵素反応に悪影響を及ぼす場合があります。最良の結果を得るためには、サンプルの種類に最適な抽出プロトコールを使用してください。RNAシーケンス実験の場合は、逆転写によってRNAをcDNAに変換します。

ほとんどのNGSワークフローでは、抽出後にQCステップが必要となります。純度評価にはUV分光光度法を、核酸の定量には蛍光測定法を用いることをお勧めします。

NGSワークフローのステップ1:ライブラリー調製

ライブラリー調製は、NGSワークフローを成功させるために極めて重要です。このステップでは、DNAまたはRNAサンプルをシーケンサーに対応できるように調製します。基本的には、DNAを断片化し、その両端に特異的なアダプターを付加してシーケンスライブラリーを作成します。イルミナのシーケンスワークフローでは、これらのアダプターは、DNA断片をフローセルに結合できるようにする相補配列を含みます。次に、これらの断片を増幅して精製します。

リソースを節約するために多数のライブラリーを1つにまとめて複合ライブラリーとし、1回のランでシーケンスすることもできます。このプロセスはマルチプレックスとも呼ばれます。アダプターライゲーション時に、固有のインデックス配列である「バーコード」を各ライブラリーに加えます。データ解析時に、これらのバーコードを使用して各ライブラリーを識別します。

ライブラリー調製の資料

ライブラリーの定量および品質管理に関するガイダンスをご覧いただけます。

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DNA/RNAを精製する際にコンタミネーションを防止する方法をご覧いただけます。

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NGSワークフローのステップ2:シーケンス

NGSワークフローのシーケンスステップ時に、ライブラリーをフローセルにロードしてシーケンサーにかけます。クラスター形成と呼ばれるプロセスでDNA断片のクラスターが増幅され、一本鎖DNAの何百万ものコピーが得られます。イルミナの大部分のシーケンサーでは、自動的にクラスター形成が行われます。

Sequencing by Synthesis(SBS)と呼ばれるプロセスでは、化学修飾ヌクレオチドが相補的にDNAテンプレート鎖に結合します。各ヌクレオチドには蛍光タグと次の塩基への結合をブロックする可逆的ターミネーターが含まれています。蛍光シグナルによってどのヌクレオチドが付加されているかが示されます。次にターミネーターが切断されて次の塩基が結合できるようになります。

DNAの順鎖を読んだ後そのリードは洗い流され、逆鎖に対しこのプロセスが再度行われます。この方法をペアエンドシーケンス法と呼びます。

NGSワークフローのステップ3:データ解析

シーケンス後に装置に搭載されたソフトウェアがヌクレオチドを識別し(ベースコールと呼ばれるプロセス)、そのベースコールの予測精度を特定します。データ解析時に、シーケンスデータを標準解析ツールにインポートしたり、ご自身のパイプラインを設定したりすることができます。

現在では、バイオインフォマティクスのトレーニングを受けたり、ラボスタッフを追加したりせずに、直感的に操作できるデータ解析アプリを使用してNGSデータを解析できます。これらのツールには、シーケンスアライメント、バリアントコール、データの可視化、または解釈機能が備わっています。

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NGSワークフローをすぐに開始

いち早く開始することをご希望ですか?当社の「ワークフローの設計・評価サービス」*で実験計画の専門家にご相談ください。適切なNGSワークフローを設計し、サンプルを処理し、最初のNGSデータセットを生成できるようお客様を支援します。

*アジアと南太平洋の諸国では、現在ご利用になれません。

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注目のNGSワークフロー

微生物の全ゲノムシーケンス

微生物の全ゲノムシーケンスを使用すれば、病原体の特定、ゲノムの比較、抗菌薬耐性の解析が可能になります。イルミナのNGSワークフローでは、このアプリケーションの各ステップに適した推奨方法と製品について説明します。

抽出キットを使用して、EDTAやフェノール:クロロホルムなどの阻害剤を加えずに微生物コロニーからDNAを分離します。UV分光光度法により純度を評価し、蛍光測定法によりDNAを定量します。

Nextera DNA Flex Guideに記載されているプロトコールに従ってライブラリーを調製、定量します。また、Agilent 2100 BioanalyzerやAdvanced Analytical Fragment Analyzerを使用して、任意でライブラリーの品質チェックを実施できます。以下のものが必要です。

推定ハンズオン時間:3.5時間
推定DNAインプット量:1~500 ng

MiSeq System Guideに記載されているプロトコールに従ってライブラリーを2 × 150 bpランでシーケンスします。以下のものが必要です。

推定ラン時間:約24時間
推定アウトプット量:4.5~5.1 Gb
1ランあたりのサンプル数:最大16(微生物ゲノム)

BaseSpace Sequence HubのSRST2アプリを使用してデータを解析します。このアプリでは、Multilocus Sequence Typing(MLST)データベース中に配列タイプが存在するかどうか、各シーケンスデータベース中にリファレンス遺伝子が存在するかどうかが報告されます。どのMLSTおよび/またはシーケンスデータベースを使用してサンプルを解析するのか指定できます。以下のものが必要です。

次のサンプルデータセットをご覧ください。MRSAおよびEnterobacter cloaecae

微生物の全ゲノムシーケンスの詳細はこちら

ガイド付きのNGSチュートリアル

NGSワークフローのステップごとのヒントから、どんなことが期待できるかご覧いただけます。

チュートリアルはこちら

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qPCRからRNA-Seqまでのワークフローガイダンス

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