NGSワークフローのステップ

ライブラリー調製は、NGSワークフローを成功させるために極めて重要です。このステップでは、DNAまたはRNAサンプルをシーケンサーに対応できるように調製します。基本的には、DNAを断片化し、その両端に特異的なアダプターを付加してシーケンスライブラリーを作成します。イルミナのシーケンスワークフローでは、これらのアダプターは、DNA断片をフローセルに結合できるようにする相補配列を含みます。次に、これらの断片を増幅して精製します。

リソースを節約するために多数のライブラリーを1つにまとめて複合ライブラリーとし、1回のランでシーケンスすることもできます。このプロセスはマルチプレックスとも呼ばれます。アダプターライゲーション時に、固有のインデックス配列である「バーコード」を各ライブラリーに加えます。データ解析時に、これらのバーコードを使用して各ライブラリーを識別します。

ライブラリー調製の資料

NGSワークフローのシーケンスステップ時に、ライブラリーをフローセルにロードしてシーケンサーにかけます。クラスター形成と呼ばれるプロセスでDNA断片のクラスターが増幅され、一本鎖DNAの何百万ものコピーが得られます。イルミナの大部分のシーケンサーでは、自動的にクラスター形成が行われます。

Sequencing by Synthesis（SBS）と呼ばれるプロセスでは、化学修飾ヌクレオチドが相補的にDNAテンプレート鎖に結合します。各ヌクレオチドには蛍光タグと次の塩基への結合をブロックする可逆的ターミネーターが含まれています。蛍光シグナルによってどのヌクレオチドが付加されているかが示されます。次にターミネーターが切断されて次の塩基が結合できるようになります。

DNAの順鎖を読んだ後そのリードは洗い流され、逆鎖に対しこのプロセスが再度行われます。この方法をペアエンドシーケンス法と呼びます。