NGSワークフローステップ

NGSワークフローの成功にはライブラリー調製が不可欠です。このステップでは、DNAまたはRNAサンプルがシーケンサーと互換性を持つように調製します。シーケンスライブラリーは通常、DNAを断片化し、専用アダプターを両端に追加することで作成されます。イルミナのシーケンスワークフローでは、これらのアダプターにはDNA断片がフローセルに結合できる相補的なシーケンスが含まれています。その後、断片を増幅および精製することができます。

リソースを節約するために、複数のライブラリーを一緒にプールし、同じランでシーケンスすることができます。これはマルチプレックスと呼ばれるプロセスです。アダプターライゲーション中に、固有のインデックスシーケンスまたはバーコードが各ライブラリーに追加されます。これらのバーコードは、データ解析中にライブラリーを区別するために使用されます。

ライブラリー調製リソース

NGSワークフローのシーケンスステップでは、ライブラリーがフローセルにロードされ、シーケンサーに配置されます。DNA断片のクラスターはクラスター生成と呼ばれるプロセスで増幅され、何百万もの一本鎖DNAのコピーが生まれます。ほとんどのイルミナシーケンス装置では、クラスター形成が自動的に行われます。

合成によるシーケンス（SBS）と呼ばれるプロセスでは、化学修飾されたヌクレオチドは自然相補性を介してDNAテンプレート鎖に結合します。各ヌクレオチドには蛍光タグと、次の塩基の取り込みをブロックする可逆的ターミネーターが含まれています。蛍光シグナルはどのヌクレオチドが添加されたかを示し、ターミネーターは切断され、次の塩基が結合できるようになります。

順方向DNA鎖を読んだ後、リードは洗浄され、逆方向鎖に対してプロセスが繰り返されます。この手法はペアエンドシーケンスと呼ばれます。

シーケンス後、装置ソフトウェアはヌクレオチド（ベースコーリングと呼ばれるプロセス）とそれらのベースコールの予測精度を特定します。データ解析中、シーケンスデータを標準解析ツールにインポートしたり、独自のパイプラインを設定したりできます。

今日では、直感的なデータ解析アプリを使用して、バイオインフォマティクストレーニングやラボスタッフの追加なしにNGSデータを解析することができます。これらのツールは、シーケンスアライメント、バリアントコーリング、データ可視化、または解釈を提供します。