NGSとqPCRの比較

NGSとqPCRの違い

次世代シーケンサー（NGS）と定量的PCR（qPCR）テクノロジーを比較する場合、主な違いはディスカバリーパワーです。どちらも高感度で信頼性の高いバリアント検出を提供しますが、qPCRが検出できるのは既知のシーケンスのみです。対照的に、NGSは、シーケンス情報の事前知識を必要としない仮説を介さない方法です。NGSは、新規遺伝子を検出するためのより高いディスカバリーパワーと、希少バリアントや転写産物を定量化するためのより高い感度を提供します。

NGSテクノロジーとqPCRテクノロジーは、スケーラビリティとスループットも異なります。qPCRはターゲット数が少ない場合効果的ですが、複数のターゲットではワークフローが煩雑になることがあります。NGSは、数多くのターゲットやサンプルを用いた研究に適しています。1回のNGS実験で、数千のターゲット領域にわたるバリアントを単一塩基分解能で同定できます。

NGSとqPCRの比較：詳細な比較

qPCRと比較した場合、特定のNGS法では以下のことが可能です。

既知の転写産物と新規の転写産物の両方を検出
個々のシーケンスリードを定量化して、相対値だけでなく絶対的な発現値を生成
遺伝子発現のわずかな変化を10%まで検出
新規転写物、交互スプライシングアイソフォーム、スプライス部位、および低分子RNA種とノンコーディングRNA種を同定
プロファイル > 1回のアッセイで1000のターゲット領域

qPCRとターゲットNGSの比較

	qPCR qPCRでは、特定の場所における特定のバリアントの解析が可能です。	ターゲットNGS ターゲットNGSは、数百から数千の遺伝子を同時にシーケンスします。
利点^1-5	使い慣れているワークフローほとんどのラボにあるアクセシブルな機器	高いシーケンス深度により高感度を実現（1%まで）より高い検出力* より高い変異分解能† 大規模並列シーケンスにより、ハイスループットワークフローと大規模データセットを実現遺伝子発現の変化を10%まで検出
課題^1-5	あらかじめ定義された一連のトランスクリプトのみにアクセス既知の転写産物のみを検出し、検出力を制限限られたスループットと変異分解能	少数のターゲットをシンプルに検出するのは必ずしもそれほど効率的ではない

* 発見力とは、新規バリアントを同定する能力です。

† 変異分解能とは、同定された変異のサイズです。NGSは、1塩基変異までの大きな染色体再構成を同定できます。

バリアントの同定において、遺伝子関連研究は当たり外れが多く特段の目的なしに情報を発見する目的で行われる調査のようなものであることが明らかになりました。NGSでは、ゲノムのはるかに大きな部分を同時に見ることができることに気づいたのです。

Linda S. Pescatello, PhD
コネチカット大学キネシオロジー学部ディスティングイッシュト・プロフェッサー

RNA-SeqとqPCRの利点

qPCRは少数の遺伝子の発現を定量化するのに有用である一方、既知のシーケンスしか検出できません。対照的に、NGSを用いたRNAシーケンス（RNA-Seq）では、既知の転写産物と新規の転写産物の両方を検出できます。RNA-Seqは事前に設計済みプローブを必要とせず、データセットにバイアスがないため、仮説を使用しない実験デザインが可能になります。

qPCRと比較した場合のRNA-Seqの主な利点：

より高いディスカバリーパワーで新規転写産物を検出
より高い感度でまれなバリアントや発現量の低い遺伝子を検出
より高いスループットで複数のサンプルにわたる複数の遺伝子の同時シーケンス
より広いダイナミックレンジでバックグラウンドノイズやシグナル飽和なしに遺伝子の発現を定量化

NGSとqPCRの使い分け

NGSとqPCRのどちらを選択するかは、サンプル数、ターゲット領域内のシーケンス合計量、予算上の検討事項、研究目標など、いくつかの要因に依存します。ターゲット領域数が少ない場合（≤ 20ターゲット）や研究の目的が既知のバリアントのスクリーニングまたは同定に限定されている場合は、通常qPCRがより適しています。

そうでない場合は、NGSの方がニーズに合うでしょう。ターゲットNGS手法は、複数のサンプルで複数の遺伝子を同時にシーケンスできるため、従来の反復法に比べて時間とリソースを節約できます。また、NGSは検出力がより高く、新規バリアントの検出を可能にします。

動画を視聴：qPCRの代わりにNGSを使用する

qPCRからNGSへの移行

MiSeqシステムにより、次世代シーケンスのパワーをこれまで以上に簡単かつ手頃な価格でラボにもたらすことができます。シーケンスが完了すると、Correlation Engineなどのツールにより、以前のqPCRデータとNGSデータが比較できます。

ライブラリー調製

Illumina Stranded mRNA Prep

コーディングトランスクリプトームを解析するシンプルでスケーラブル、費用対効果が高く、1日で完了できる迅速ソリューション。

RNA Prep with Enrichment + ターゲットパネル

卓越したキャプチャー効率とカバレッジの均一性で、膨大な数の標的遺伝子の迅速な探索を実現します。

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参考文献

Ozsolak F, Milos PM. RNA-Sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2011;12:87-98.
Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009;10:57-63.
Myllykangas S and Hanlee JP. Targeted deep resequencing of the human cancer genome using next-generation technologies. Biotechnol Genet Eng Rev. 2010; 27: 135–158.
Illumina. High-impact discovery through gene expression and regulation research. https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/gated/gene-expression-profiling-e-book-web.pdf. 2023年3月23日にアクセス。
Illumina. Advantages of next-generation sequencing vs qPCR. https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/ngs-vs-qpcr.html. アクセス日：2023年5月22日

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