マルチプレックスランにおけるインデックスホッピングの軽減

インデックスの組み換えと関連するシーケンスリードのミスアライメントを回避するためのヒントとベストプラクティス

インデックスホッピングを軽減するためのベストプラクティス

次世代シーケンスシーケンス(NGS)テクノロジーの改良によってシーケンススピードが大幅に向上し、データ出力が飛躍的に増加したことにより、最新のシーケンスプラットフォームでは大規模なサンプルスループットが可能になりました。 この飛躍的に向上したデータ出力を有効に利用するためには、マルチプレックス法の使用がカギとなります。 マルチプレックス法は、ライブラリー調製時に各DNA断片にインデックスと呼ばれる固有の配列を付加することで行います。

これによって、1回のシーケンスランで同時に多数のライブラリーをプールし、シーケンスすることが可能になります。 しかしながら、マルチプレックス法におけるライブラリー間のインデックスのミスアサインメントは、使用されるライブラリー調製またはシーケンスシステムに関係なく存在します。 インデックスホッピングは、デマルチプレックス中にシーケンスリードを間違ったインデックスに割り当てることにより、ミスアライメントにつながる可能性があります。

インデックスホッピングの影響および軽減戦略

一般的なレベルのインデックスホッピングと下流アプリケーションに対する影響を理解しましょう。

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インデックスホッピングまたはインデックスの組み換えは、サンプルマルチプレックスが開発されて以来、NGSテクノロジーに影響を与えている現象として知られています1。特定のタイプのミスアサインメントが引き起こされ、その結果、(マルチプレックスプールにおいて)予期されるインデックスとは違うインデックスがライブラリーに誤って割り当てられます(ミスアサインメント)。

インデックスホッピングは整列化フローセル中のインデックスのミスアサインメントの増加を引き起こす主な原因となります。 遊離アダプターのレベルが高いライブラリーでは、インデックスホッピングの発生率が高くなります。

Free Adaptor Drives Index Hopping Rates
インデックスミスアサイメントの影響

インデックスミスアサイメントの影響

インデックスのミスアサイメントの原因とインデックスホッピングの影響を軽減するためのベストプラクティスはこちら。

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インデックスホッピングが発生する可能性はありますが、ほとんどのアプリケーションでその影響は限られており、バックグラウンドのホッピングが発生したリードはノイズとして除去できます。 整列化フローセルシステム上のインデックスホッピングの一般的レベルは、ライブラリーのタイプ、クオリティ、および取り扱いによりますが、0.1~2%の範囲です。 ユニークなデュアルインデックスの組み合わせを使用することで、予期されない組み合わせは未定義として割り当てられることになるため、インデックスホッピングが発生したリードが下流の解析から排除されます。

Index Hopping by Library Type

インデックスホッピングのレベルと影響を最小限に抑えるために、以下のようなライブラリー調製のベストプラクティスを実践してください:

  • ライブラリー調製から遊離アダプターを除去する
  • ライブラリーは個別に-20°Cで保管する
  • シーケンス前にライブラリーをプールする
  • プールにはユニークなデュアルインデックスの組み合わせを使用する(ユニークなi5インデックスとi7インデックス)
Index Hopping Rates for 4-plex PCR-Free Library

イルミナではユニークなデュアルインデックスの数を拡大しています。 新しいインデックスを段階的に販売開始し、24プレックスのインデックスを最初にリリースしてから、96プレックスまでインデックスを増加させる予定です。 ユニークなデュアルインデックスにより、予期されない組み合わせを除外し、正しいインデックスの組み合わせを持つ「真のデータ」のみに焦点を当てることができます。

以下のキットは、新しいユニークなデュアルインデックスキットと互換性があります:

イルミナでは、ライブラリー内のフリーアダプターのレベルを下げるのに役立つ酵素法も開発しています。 この手順はライブラリー調製後に行われ、インデックスホッピングレベルをさらに軽減します。

詳細情報については、以下のリソースをご覧ください:

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参考文献
  1. Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Res. 2012:2513–2524.