インデックスホッピング
マルチプレックスランにおけるインデックスホッピングの最小化
インデックススイッチングに関連するシーケンスリードのミスアライメントを回避するためのヒントとベストプラクティス
インデックスホッピングとは？
インデックスホッピングまたはインデックススイッチングは、サンプルマルチプレックスが開発された時点からNGSテクノロジーに影響を与えた既知の現象です。1 特定のタイプのミスアサインメントが発生し、予想されるインデックスからマルチプレックスプールの異なるインデックスへのライブラリーの割り当てが不正確になります。
インデックスホッピングはまれですが、除外増幅ケミストリーを持つパターン化フローセルを使用する装置では、パターン化フローセルを使用しない装置と比較して、わずかに高いレベルで見られます。パターン化フローセルシステムにおけるインデックスホッピングの 典型的なレベルは、ライブラリーの種類、品質、および取り扱いに応じて0.1～2%の範囲です。
マルチプレックスによる容量の増加
次世代シーケンサー（NGS）テクノロジーの改善により、シーケンス速度とデータ出力が大幅に向上し、現在のシーケンスプラットフォームの膨大なサンプルスループットが実現しました。この容量の増加を利用する鍵はマルチプレックスです。マルチプレックスは、ライブラリー調製中に各DNA断片にインデックスと呼ばれる固有のシーケンスを追加します。これにより、1回のシーケンスラン中に多数のライブラリーをプールし、同時にシーケンスすることができます。
プールされたライブラリーからのシーケンスリードは、最終データ解析の前にデマルチプレックスと呼ばれるプロセスで同定し、計算的にソートする必要があるため、マルチプレックスによるスループットの向上には複雑さが加わります。しかし、マルチプレックスでは、使用するライブラリー調製法やシーケンスシステムに関係なく、インデックスホッピングの可能性が存在します。インデックスホッピングは、デマルチプレックス中にシーケンスリードを誤ったインデックスに割り当て、ミスアライメントにつながる可能性があります。
インデックスホッピングの影響とは？
インデックスホッピングは起こり得、 パターン化フローセルを使用する装置ではわずかに高いレベルで見られますが、ほとんどのアプリケーションでは影響が限られており、バックグラウンドホッピングリードはノイズとしてフィルターで除去できます。 フリーアダプターのレベルが高いライブラリーでは、インデックスホッピングのレベルが高くなります。しかし、ユニークなデュアルインデックスの組み合わせを使用すると、予期しない組み合わせが未確定として割り当てられるため、下流の解析からホッピングされたリードを排除できます。
インデックスホッピングを最小限に抑える方法
インデックスホッピングのレベルと影響を最小限に抑えるために、お客様は以下のライブラリー調製のヒントとベストプラクティスに従う必要があります。
- ユニークデュアルインデックス（UDI）プーリングの組み合わせ（ユニークi5およびi7インデックス）を使用
- ライブラリー調製からフリーアダプターを取り出します
- ライブラリーは-20°Cで個別に保管します
- シーケンス前にライブラリーをプール
デュアルインデックス配列
シーケンス用のライブラリーをプーリングする場合、コンビナトリアルデュアルインデックスではなく、固有のデュアルインデックスを使用することをお勧めします。独自のデュアルインデックスにより、ホッピングされたリードをフィルタリングすることでインデックスホッピングを軽減します。
ユニークデュアルインデックスの詳細はこちら分子バーコード（UMI
分子バーコード（UMI）は、分子バーコーディングの一種で、シーケンス時にエラー補正を行って精度を向上させることができます。UMIを用いたシーケンスにより、偽陽性バリアントコールを減らし、バリアント検出の感度を向上させることができます。
UMIの詳細はこちらインデックスホッピングの軽減
独自のデュアルインデックスにより、研究者は予想外の組み合わせを削除し、正しいインデックスの組み合わせで真データのみにフォーカスすることができます。当社では、ユニークなデュアルインデックスの数を増やしています。ユニークなデュアルインデックスと互換性のあるライブラリー調製製品の例：
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参考文献
- Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Double indexingは、イルミナプラットフォーム上のマルチプレックスシーケンスの不正確さを克服します。Nucleic Acids Res. 2012:2513–2524。