マルチプレックスによる容量の増加
次世代シーケンサー（NGS）テクノロジーの改善により、シーケンス速度とデータ出力が大幅に向上し、現在のシーケンスプラットフォームの膨大なサンプルスループットが実現しました。この容量の増加を利用する鍵はマルチプレックスです。マルチプレックスは、ライブラリー調製中に各DNA断片にインデックスと呼ばれる固有のシーケンスを追加します。これにより、1回のシーケンスラン中に多数のライブラリーをプールし、同時にシーケンスすることができます。
プールされたライブラリーからのシーケンスリードは、最終データ解析の前にデマルチプレックスと呼ばれるプロセスで同定し、計算的にソートする必要があるため、マルチプレックスによるスループットの向上には複雑さが加わります。しかし、マルチプレックスでは、使用するライブラリー調製法やシーケンスシステムに関係なく、インデックスホッピングの可能性が存在します。インデックスホッピングは、デマルチプレックス中にシーケンスリードを誤ったインデックスに割り当て、ミスアライメントにつながる可能性があります。
インデックスホッピングとは？
インデックスホッピングまたはインデックススイッチングは、サンプルマルチプレックスが開発された時点からNGSテクノロジーに影響を与えた既知の現象です。1 特定のタイプのミスアサインメントが発生し、予想されるインデックスから別のインデックスへの（マルチプレックスプール内の）ライブラリーの誤った割り当てが発生します。
インデックスホッピングは、除外増幅ケミストリーを持つパターン化フローセルを使用する装置では、パターン化フローセルを使用しない装置と比較して、わずかに高いレベルで見られます。フリーアダプターのレベルが高いライブラリーでは、インデックスホッピングのレベルが高くなります。
影響とは？
インデックスホッピングが発生する可能性はありますが、ほとんどのアプリケーションへの影響は限定的であり、バックグラウンドホッピングリードはノイズとしてフィルタリングできます。パターン化フローセルシステムにおけるインデックスホッピングの一般的なレベルは、ライブラリーの種類、品質、取り扱いに応じて0.1～2%の範囲です。独自のデュアルインデックスの組み合わせを使用すると、予期しない組み合わせが未確定として割り当てられるため、下流の解析からホッピングされたリードを排除できます。
ヒントとベストプラクティス
インデックスホッピングのレベルと影響を最小限に抑えるために、お客様は以下のライブラリー調製のベストプラクティスに従う必要があります。
- ライブラリー調製からフリーアダプターを取り出します
- ライブラリーは-20°Cで個別に保管します
- シーケンス前にライブラリーをプールする
- 独自のデュアルインデックスプーリングの組み合わせ（固有のi5およびi7インデックス）を使用
デュアルインデックス配列
シーケンス用のライブラリーをプーリングする場合、コンビナトリアルデュアルインデックスではなく、固有のデュアルインデックスを使用することをお勧めします。独自のデュアルインデックスにより、ホッピングされたリードをフィルタリングすることでインデックスホッピングを軽減します。
ユニークデュアルインデックスの詳細はこちら分子バーコード（UMI
分子バーコード（UMI）は、分子バーコディングの一種で、シーケンス時にエラー補正を行って精度を向上させることができます。UMIを用いたシーケンスにより、偽陽性バリアントコールを減らし、バリアント検出の感度を向上させることができます。
UMIの詳細はこちらインデックスホッピングの軽減
イルミナは、24プレックスと96プレックスのインデックスを利用可能にし、当社が提供するユニークデュアルインデックスの数を増やしています。ユニークなデュアルインデックスにより、研究者は予想外の組み合わせを削除し、正しいインデックスの組み合わせで真データにのみ焦点を合わせることができます。
これらの製品は、独自のデュアルインデックスキットに対応しています。
- Illumina DNA PCR-Free Prep
- Illumina RNA Prep with Enrichment
- Illumina Stranded mRNA Prep
- Illumina Stranded Total RNA Prep
- TruSeq DNA PCR-Free
- TruSeq DNA Nano
- TruSeq Stranded mRNA
- TruSeq Stranded Total RNA（標準、グロビン、植物キット）
また、イルミナのFree Adapter Blocking Reagentも提供しています。これは、ライブラリー内のフリーアダプターのレベルを下げるのに役立ちます。このステップはライブラリー生成後に行われ、インデックスホッピングレベルをさらに低減します。
追加情報
詳細については、以下のリソースを参照してください。
- Nexteraライブラリー調製のベストプラクティス（ビデオ）
- TruSeqサンプル調製のベストプラクティス（ウェビナー）
- Nextera DNA Sample Preparation Kit（ウェビナー）
- ユニークデュアルインデックス&関連ライブラリー調製キットの理解（速報）
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イルミナによるトレーニング
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参考文献
- Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Doubleインデックスは、イルミナプラットフォーム上のマルチプレックスシーケンスの不正確さを克服します。Nucleic Acids Res. 2012:2513–2524。