CRISPRゲノム編集とNGS
CRISPRゲノム編集の応用
CRISPR-Cas9技術は、基礎研究、臨床研究、薬物療法、創薬、農業、および環境の分野で応用されていることが分かっています。臨床研究では、がん、AIDS、ハンチントン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの疾患においてCRISPRを利用できる可能性が示されています。
CRISPRゲノム編集により、研究者は遺伝子改変細胞株や動物モデルを迅速かつ精確に作製することができます。遺伝子ノックアウトの作製や特異性の高い改変の他にも、研究者はCRISPR技術によりゲノム配列を変化させずに阻害（CRISPRi）や活性化（CRISPRa）を介して遺伝子発現を調節することができます（表）。
CRISPRノックアウトとその他の編集の確認
CRISPRゲノム編集実験からは細胞集団が混じり合ったものが得られ、その中の小さなサブセットのみで目的の編集がされています。研究者は、どの細胞に目的のCRISPRノックアウトや標的変異があるのかを判断する必要があります。編集を評価する現行の手法には、切断アッセイ、PCR、サンガー法、およびNGSなどがあります（表）。
NGSは、全ての種類の改変にわたり高解像度で定性的情報も定量的情報も得ることができ、あらゆるスループットのニーズに対応でき、オフターゲット効果のモニタリングにも使用できる唯一の方法です。7 NGSを用いるターゲットシーケンスは、改変の標的領域に注目することでCRISPRによる編集を確認できるコスト効率の高いソリューションです。
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NGSを用いたCRISPRオフターゲット解析
CRISP/Cas9技術の実施を成功させるには、目的のターゲット以外の部位における意図しない改変であるオフターゲット効果を特定し、低減するストラテジーなどが必要となります。ゲノム編集実験では、RNAの特異性を評価し、オフターゲット部位を予測する計算法が広く使用されています。
オンラインツールやウェブベースのアルゴリズムが公開されています（表）。ただし、予測アルゴリズムでは見逃されるおそれのあるオフターゲット部位を発見するには、NGSによる全ゲノムシーケンス（WGS）などの全ゲノム解析が必要です。8
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オフターゲット効果を解析するためのバイアスのない方法
オフターゲット切断部位のスクリーニングのための全ゲノムアプローチには、細胞ベースアッセイとin vitroアッセイがあります（表）。
CRISPRゲノム編集による機能的影響
シングルセルRNAシーケンス
CRISPR改変後に細胞集団をスクリーニングして、何千もの個々の細胞において同時に多数の遺伝子の遺伝子制御の影響を判定
RNAシーケンス
トランスクリプトーム全体または遺伝子／遺伝子ファミリーの発現に対する変異の影響を評価
ChIP-Seq
DNAとタンパク質の結合に対する変異の影響を判定
メチル化シーケンス
メチル化状態およびクロマチンリモデリングに対する変異の下流影響を調査
主な製品
NextSeq 1000 & 2000 Systems
Groundbreaking benchtop sequencers allow you to explore new discoveries across a variety of current and emerging applications, with higher efficiency and fewer restraints.
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Illumina Stranded mRNA Prep
A simple, scalable, cost-effective, rapid single-day solution for analyzing the coding transcriptome leveraging as little as 25 ng input of standard (non-degraded) RNA.
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TruSeq ChIP Library Preparation Kit
Simple, cost-effective chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) DNA library preparation, with master mixes and robust multiplex capabilities.
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TruSeq Methyl Capture EPIC Library Prep Kit
This kit combines next-generation sequencing with epigenetic insights to accelerate biomarker discovery and understand methylation’s role in gene regulation.
Learn Moreゲノム編集におけるNGSのその他の用途
オンターゲットやオフターゲットの高解像度評価やCRISPRノックアウトや編集の機能に関する検証や評価の他にも、NGSはCRISPRゲノム編集ワークフローの別の段階に取り入れることができます。
初期設計段階において、（リファレンスゲノムのない種の）座位またはゲノムのリシーケンスはRNAの選択に役立ちます。CRISPR-Cas9とガイドRNAコンストラクトのクローニングプロセス中、得られたプラスミドをリシーケンスすることで、特に大きなプラスミドライブラリーのあるハイスループット実験の場合、CRISPR導入ベクターを迅速かつ高い信頼度で検証できます。
Francis deSouzaによるゲノミクス、CRISPR、未来
Illumina, Inc.の社長兼CEOであるFrancis deSouzaが、Aspen Ideas: コロラド州の健康は、医療全体におけるゲノミクスの影響と、より多くの人々にその利益をより迅速に提供することの緊急性について聴衆を教育します。
記事を読む
参考文献
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