マラリアでゲノムワイドなネットをキャストする

はじめに

ヒトマラリア原虫は、地球上で最も感染性の高い生物の1つです。アフリカのサハラ以南の国々では、年間2億例以上の新規感染者およびマラリアによる約50万人の死亡の原因となっており、主に5歳未満の子供に感染しています。¹感染の初期症状には、発熱、体の痛み、嘔吐があります。疾患が進行すると、被害者は発作、呼吸窮迫、重度の貧血に苦しむ可能性があります。マラリアによる死亡は、脳を含むさまざまな臓器への血流や酸素交換の障害によって起こります。

過去15年間で、世界保健機関、ビル&メリンダゲイツ財団などによって資金提供されたマラリアの抑制、根絶、および疾患治療の取り組みは、マラリアによる年間死亡率を以前の発生率のほぼ半分に減らしました。² 成功の大部分は、薬剤のアルテミシニンによる効果的なマラリア感染治療の結果です。残念なことに、マラリアの最も致命的な症例の原因となる寄生虫である熱帯熱マラリア原虫のアルテミシニン耐性株が現れ始めており、マラリアに対する最近の成功がすぐに取り消される可能性を浮き彫りにしています。

カリフォルニア大学リバーサイド校（カリフォルニア大学リバーサイド校）の細胞生物学教授であるKarine Le Roch博士は、20年間にわたり熱帯熱マラリア原虫の生物学を研究してきました。彼女の現在の研究では、遺伝子制御イベントと生物のメカニズムを理解し、新しい薬物ターゲットの同定と効果的な治療法の開発を可能にすることに重点を置いています。次世代シーケンサー（NGS）の早期導入者として、Le Roch博士はシステム生物学のアプローチを研究に適用し、ゲノムワイド研究やその他のシーケンスベースの調査手法を多用しています。

イルミナのNGSシステムがUC Riversideにおけるマラリア研究の進歩にどのように使用されているかを知るために、iCommunityはLe Roch博士と、Le Rochラボの博士研究員であるEvelien Bunnik博士、およびUC Riverside Institute for Integrative Genome Biology（IIGB）の植物細胞生物学者であり研究施設ディレクターであるGlenn Hicks博士と話をしました。

左から右へ：UCR細胞生物学教授のKarine Le Roch博士、Le Rochラボの博士研究員のEvelien Bunnik博士、IIGBの研究施設ディレクターのGlenn Hicks博士。

Q：熱帯熱マラリア原虫のライフサイクルはどのようなものですか？

Karine Le Roch（KLR）：P. falciparum malariaの寄生虫のライフサイクルは極めて複雑で、ヒト宿主間のいくつかの連続した段階を伴います。ここでは、無性寄生虫が増殖し、蚊が寄生虫の性的生殖を宿主とし、さらにヒトに寄生虫が移入する際に疾患ベクターとして機能します。P. falciparumは、その形状と構造を変化させてライフサイクルのさまざまな段階に適応させる単細胞真核生物ですが、遺伝子発現の制御方法を実際に理解している人はいません。マラリア原虫ゲノムを酵母やヒトなどの他の真核生物と比較すると、予想される転写因子は3分の1に過ぎません。

Q：P. falciparumを研究するためのアプローチはどのようなものですか？

KLR：ゲノムワイドなシステム生物学アプローチを用いて、寄生虫が転写レベルまたは転写後レベルで遺伝子発現をどのように制御するかを調べます。2Dおよび3Dレベルでのクロマチン構造と、核内および細胞質内のすべてのものを調べ、両方の宿主における遺伝子制御、細胞分化、および寄生虫の発生を理解しています。

Q：研究でゲノミクスとNGSをどのように利用していますか？

KLR：NGSで設計できる実験には多くの種類があり、私たちの想像力は、熱帯熱マラリア原虫の遺伝子制御を理解するためにテクノロジーでできることの唯一の限界です。私たちは、ChIP-Seq、Hi-C、GRO-Seq、RNA-Seq、Poly-Seq、Ribo-Seqなど、私たちが夢見ることができるすべてのゲノムワイドなタイプの研究を使用しています。* これらのゲノムワイドデータセットを組み合わせることで、コンピューターレベルで遺伝子制御をモデル化し、寄生虫に特異的なパスウェイをピンポイントで特定して新しい薬物ターゲットを発見したいと考えています。

"過去の研究の一部にマイクロアレイを使用し、騒音や背景に問題がありました。NGSを使い始めると、これらの問題は完全に消滅しました。"

Q：NGSは、研究を可能にする上でアレイと比較してどうですか？

KLR：NGSがあれば、どのような研究でも可能です。新しいタイプの実験を作成し、すべての塩基対を調べることができます。過去の研究の一部にマイクロアレイを使用し、騒音や背景に問題がありました。これらの問題は、NGSの使用を開始したときに完全に消失しました。

Evelien Bunnik（EB）：例えば、核内の熱帯熱マラリア原虫ゲノムの3D構造を調べるためにNGSを使用します。このアプリケーションでは、制限酵素消化に続いてライゲーション反応を行い、最後にペアエンドシーケンスを行います。マイクロアレイでは3Dゲノム構造情報が得られない。メチル化研究でも同じことが言えます。

Glenn Hicks（GH）：マイクロアレイを使用して、新しいトランスクリプトを見ることもできませんでした。NGSを使用してRibo-Seqを実施し、キャンパスでの研究をトランスレーショナルレベルに拡大しています。

KLR：3Dレベルでのクロマチン構造と寄生虫発生時の遺伝子制御の関係を調べることができるクロマチン研究では、NGSに依存しています。

Q：UCリバーサイドシーケンスコアとして、IIGBはいつからUCR研究者にNGSサービスを提供しましたか？

GH：当社のIIGB共同リソース組織は、実際にはNGSに先行しています。IIGBは、3730XLキャピラリーシーケンサーによるシーケンスコアとして始まり、すべてのスラブゲルシステムを大幅に改善しました。キャピラリーシーケンス技術が成熟するにつれ、イルミナのゲノムアナライザーに移行し、2008年に最初のゲノムアナライザーIIを追加しました。まもなくHiSeq 2000システムを追加し、HiSeq 2500システムにアップグレードした後、MiSeqとNextSeq 500システムを取得しました。

Q：IIGBの観点から、イルミナのNGSシステムを製品に追加することでどのようなメリットを得ましたか？

GH：イルミナのNGSは、当社がサービスを提供するすべてのグループの集中化されたリソースニーズの大部分を満たす方法でシーケンステクノロジーを活用することができます。IIGBは、生物医学研究、病原体研究、植物生物学、生態学、その他の研究を行うグループをサポートしています。ここではヒトゲノムの研究をいくつか行いますが、医学部とは異なり、エレガン、真菌、アラビドプシス、またはゼブラフィッシュも研究している可能性があります。大学のコアシーケンスサイトとして、可能な限り多くの研究ニーズに対応できる迅速かつ柔軟なシステムが必要です。カリンの研究室など、急速に成長するキャンパスで使用されている幅広い研究手法は、さまざまなNGS要件を表しています。

"NextSeq 500システムは費用対効果が高く、迅速で、マラリア原虫のATリッチゲノムのシーケンスが可能です。"

Q：IIGBサービスにNextSeq 500システムを追加したのはなぜですか？

GH：HiSeq Systemsの8レーンフローセルは、特定の大規模プロジェクトに最適です。しかし、研究グループが全ゲノムシーケンスプロジェクトに加えて、RNA-Seqのようなより多くの解析実験を行っている傾向が見られます。NextSeq 500システムは、このニーズを効果的にサポートできます。

一度に1～3個のサンプルのシーケンスを求める声が増えています。HiSeqフローセルを充填するために十分なサンプルを蓄積するには、特に頻繁に実行しないフローセルタイプでは、かなりの時間がかかる場合があります。NextSeq 500システムは、HiSeqシステムでサンプルのシーケンスを行うのに時間がかかりすぎたKarineのような研究者のニーズに応えることができたため、魅力的でした。HiSeqフローセルを充填する要件をなくすことで、NextSeq 500システムは、非ルーチンサンプルのシーケンスの待ち時間を数週間または数か月からわずか1週間以下に短縮することができました。小規模なプロジェクトはサンプルの受領から数日以内に完了できるため、助成金の期限前に予備データを生成することができます。これにより、補助金に対するUCR研究者の競争力が向上します。

"NextSeq 500システムを使用して、クロマチンの構造変化と性分化の関係を研究しています。"

Q：IIGBがNextSeq 500システムを追加した後、あなたとラ・ロシュラボは、熱帯熱マラリア原虫研究の途中で新しいシーケンスシステムを採用することについて懸念を抱きましたか？

KLR：NextSeq 500システムはAT含有量の高いゲノムには最適ではないと考えたため、少し心配していました。P. falciparumゲノムはAT約80%であるため、これは私たちにとって問題となります。バイサルファイト変換ライブラリーを用いたNextSeq 500システムのパイロット研究を行い、遺伝子発現に関連するPlasmodiumのエピジェネティックパターンに関するデータを生成しました。よくできました。

NextSeq 500システムにご満足いただいております。当社のシーケンス能力が向上し、HiSeq 2500システムと比較してデータ品質に大きな違いはありません。NextSeq 500システムはコスト効率が高く、迅速で、マラリア原虫のATリッチゲノムのシーケンスが可能です。今では、すべてのシーケンスを行ないます。

"...NextSeq 500システムは、非ルーチンサンプルのシーケンスの待ち時間を数週間から数か月、場合によってはわずか1週間以下に短縮することができました。"

Q：NextSeq 500システムはIIGBサービスの提供に影響を与えましたか？

GH：2015年9月にNextSeq 500システムを受け取り、1週間以内に稼働を開始しました。NextSeq 500システムがオンラインになった後、新しい高速シーケンサーが登場したことを研究者に伝えるだけでした。過去3か月で、採用が劇的に増加しており、システムは常時稼働しています。ターンアラウンドが速いほど、研究者はデータを迅速にレビューし、次に実行する実験を決定し、より多くのサンプルでシーケンスに戻ることができます。多くの研究者が、研究をNextSeq 500システムへと急速に移行しています。サンプルあたりの収率が高く、マルチプレックスレベルが高いため、コスト効率が高くなります。当社のシステムは、大学の行政機関によってサポートされ、強力な中央インフラの利点と、それがUC Riversideでの研究の成功にどのようにつながるかを理解しています。

Karineのラボは、このキャンパスのNextSeq 500システムへの移行の最前線に立っています。彼らは常に新しい手法やアプローチを試しています。この種の実験アプローチでは、迅速なターンアラウンドが必要です。次のランのために実験をどのように修正するかを決定するには、結果を迅速に得る必要があります。NextSeq 500システムは、すべてがより速く動くため、サイエンティストの研究能力を高めたと言えるでしょう。その意味で、私たちが期待していたものは何でもありました。

Q：NextSeq 500システムは、現在のマラリア研究をどのように実現しましたか？

KLR：寄生虫の発生とその性分化を阻止する方法を理解する必要があります。宿主ベクターへの寄生虫の伝播には、性的に成熟した配偶子細胞が必要です。最近では、NextSeq 500システムを使用して、クロマチンの構造変化と性的分化の関係を研究しています。

性分化に関連するハプロイドゲノムについて、いくつかのユニークで異型的なクロマチン構造を特定しました。これが寄生虫特異的な薬物標的の発見につながることを願っています。性分化を止めることができると、病気の伝播を止めることができます。

参考文献

1. 世界保健機関。ファクトシート：World Malaria Report 2015. www.who.int/malaria/media/world-malaria-report-2015/en/ 2016年7月6日にアクセス。
2. 世界保健機関。Global Health Observatory（GHO）データ：マラリアによる死亡者数。www.who.int/gho/malaria/epidemic/deaths/en/ 2016年7月6日にアクセス。