口腔内の微生物のシーケンス
MiSeqシステムにより、Saca la Lenguaプロジェクト研究チームは数千のサンプルのシーケンスを行い、ヒトの口腔内に存在するさまざまな細菌や真菌を特定することができます。
口腔内の微生物のシーケンス
はじめに
礼儀正しい会社で舌を打たないように教えられたのは、まさに生物学者のToni Gabaldón博士が、サカ・ラ・ラングアプロジェクトの一環として何千人ものスペインのティーンエイジャーに依頼したことです。1 スペイン語の“舌を打つ”の目標は、スペイン全土の15歳児の口腔内微生物叢を調査し、口の中で生き生きる何千ものさまざまな微生物について学ぶことです。バルセロナのCentre for Genomic Regulation（CRG）のGabaldón博士らは、MiSeqシステムを使用して、スペイン全土の高校生から提供された1,600を超える口腔サンプルをシーケンスしています。
“Saca la LenguaはCRGで行っている科学を紹介する優れたプロジェクトでした”とGabaldón博士は述べました。マイクロバイオーム研究は、急速に拡大している新しい分野です。微生物叢とヒトの疾患を結び付け、私たちの食生活やライフスタイルが微生物叢にどのように影響するかを結びつける新しい発見が日々行われています。これらの発見には、データを解析するための高度なシーケンス技術とバイオインフォマティクスツールが必要です。MiSeqやHiSeqシステムなどの次世代シーケンサー（NGS）システムなどの技術開発により、現在では、体内および体内に生息する微生物の多様性を迅速かつ低コストで評価できるようになりました。これは数年前まで不可能でした。
Saca la Lenguaは単なる微生物遺伝学プロジェクトではありません。市民科学と地域社会への働きかけを組み合わせ、次世代の科学への関心を刺激します。データ解析はまだ完了していませんが、Gabaldón博士とその同僚たちは、口腔内微生物叢に関する重要かつ驚くべき発見をすでに始めています。
真菌微生物叢の研究
ここ数年、微生物叢の研究は注目の的になっています。しかし、この新しい研究分野のすべての側面が繁栄しているわけではありません。腸と皮膚の細菌微生物叢の研究が、この分野を支配しています。真菌の培養が難しく、その結果、堅牢なゲノムデータベースがないため、真菌微生物叢の研究は遅れています。また、微生物叢全体のごく一部を占めることもよくあります。濃度は低いかもしれませんが、口腔内微生物叢に真菌が存在すると、大きな影響が及ぶ可能性があります。
“口腔内微生物叢をアフリカのサバンナの生態系と考えてください”とGabaldón博士は述べました。ゼブラと比較してライオンはごくわずかかもしれませんが、ライオンを取り除きれば生態系全体が変わることになります。真菌も同じような役割を果たします。一部の真菌は抗菌薬化合物を産生し、その他の真菌は細菌のコロニー形成を促進する化合物を産生します。真菌は酸素を消費し、pHを変化させ、口腔内の生態系を変化させます。虫歯を引き起こす種の1つであるStreptococcus mutansという細菌が酵母のCandida albicansと協調して増殖すると、肯定的なフィードバックループが生まれ、空洞が大きく速く増殖します。
真菌ゲノミクスは細菌ゲノミクスよりも研究が困難です。細菌ゲノムをシーケンスするために、サイエンティストは所与の領域を増幅するユニバーサルマーカーを開発し、これらのマーカーは多くの異なる細菌種にわたって同様の方法で機能しています。対照的に、DNAを抽出してシーケンスするために厚い真菌細胞壁を破って開けることは困難です。既存のプライマーやその他のツールも、バクテリアのように真菌では機能しない傾向があります。
その結果、ヒトの口の中に生息する真菌の種類に関する情報はほとんど得られません。Gabaldón博士は、利用可能な研究は、特定の疾患を持つ人々の小さなサンプル研究に基づく数少ないと述べています。若い集団を対象とした研究はありません。Saca la Lenguaプロジェクトは、真菌微生物叢に関するこの重要な情報のギャップを埋める貴重な機会を提供してくれました。
MiSeqシステムは、ハイスループットシーケンスとロングリードの優れた組み合わせを提供してくれました。
Saca la Lenguaが登場
口腔内微生物叢の真菌についてはあまり知られていないため、 Gabaldón博士はCRGディレクターのLuis Serrano博士とCentre for Genomic Regulationのシーケンスコアにこれらの生物をSaca la Lenguaプロジェクトに含めることを提案しました。彼らはすぐに同意しました。La Caixa Bankからの資金で、Gabaldón博士らは高校の教師に電話をかけました
スペイン全土に 彼らは特に15歳の子供に焦点を当てました。なぜなら、多くのスペインのティーンエイジャーが、高校の学位取得のために科学または別のテーマに焦点を絞るかどうかを決定している時代だからです。たとえこのプロジェクトに参加しても、これらのティーンエイジャーの何人かが科学の追求を奨励できなかったとしても、科学の識字率を向上させることができます。
このような狭い年齢範囲に焦点を当てることで、研究者が口腔内微生物叢の違いを比較しやすくなりました。“これらの若者は病院ではなく高校から採用されている”とGabaldón博士は述べました。喘息などの疾患の発生率は、正常集団に見られることを反映しています。この集団の微生物叢と、その微生物叢がどのように異なる要因で変化するかについて説明したいと思います。
“研究の観点から、Saca la Lenguaプロジェクトは優れた正常サンプル一式を取得しました”とGabaldón博士は付け加えました。彼らは全員、年齢管理集団の同じ地域に住んでいます。同様の研究を見ると、サンプルがこれほど多い研究は見つかりません。
1,600人を超えるスペインのティーンエイジャーたちは、口内微生物のサンプルを提供するだけでなく、食事、衛生、ライフスタイルに関する一連の質問に答えました。研究者は、これらの変数が微生物叢に与える影響だけでなく、家族の社会経済的地位の影響や、青年が都市部または農村部に住んでいるかどうかを比較したいと考えています。
MiSeqシステムがシーケンスの主力製品になる
CRGチームはMiSeqシステムを利用してシーケンス作業を実施しました。DNA抽出を実施する前に、すべてのサンプルを収集するまで待機しました。次に、同じMiSeqフローセルレーンにバーコード化されたサンプルをプールし、シーケンスラン数とサンプルごとに得られる情報量を最適化しました。Saca la Lenguaチームは、全ゲノムショットガンアプローチを使用するのではなく、ターゲットアプローチを使用し、リボソームRNAをコードする領域のみを増幅しました。細菌では16S rRNAを、真菌では18S rRNAを調べました。これらの領域は、微生物種の同定に関する貴重な情報を提供します。“MiSeqシステムはハイスループットシーケンスとロングリードの優れた組み合わせを提供してくれました”と Gabaldón博士は述べました。Roche 454を用いた以前の研究を実施しましたが、スループットはMiSeqシステム得られたものに近いものでさえありませんでした。また、リードはリボソームRNAシーケンスに隣接する2つのプライマー間のDNA領域とオーバーラップするのに十分な長さで、関心領域全体の増幅を可能にしました。
Dr. GabaldonのチームがリボソームRNA遺伝子をターゲットにしたプライマーにはイルミナの機能アダプターも含まれており、ライブラリー調製とシーケンスの間のシームレスな移行を実現します。完成したライブラリーは、MiSeqシステム上でシーケンスするためにCRGコアラボに直接送られました。Gabaldón博士は、私たちが使用したプロトコールは、この種の研究の実施に関心のある科学者が利用できます。
MiSeqシステムに加えて、チームはHiSeqシステムを使用して真菌ゲノムのリシーケンスとde novoシーケンスを行います。“ゲノムからペアエンドライブラリーとメイトペアライブラリーを調製し、RNA-Seqも実行します”とGabaldón博士は述べました。
真菌はどこにありますか？
シーケンスを開始した直後、Gabaldón博士と彼のチームは、サンプルの多くは真菌の兆候を示さないことに気づきました。彼らはサンプルの一部を培養し、30歳以上のCRGスタッフからのサンプルとシーケンス結果をダブルチェックしました。低濃度または真菌が完全に存在しないことが、この10代集団の口腔内微生物叢の特徴であることを確認しました。\\"この結果は期待しておらず、何らかの意味合いを持つ可能性があると Gabaldón博士は述べました。その真菌が後年の口腔内微生物叢にコロニーを形成する可能性があります。食習慣との相関関係があるかどうかは不明です。言うには時期尚早です。
イルミナのシーケンスシステムでは、全ゲノムシーケンスを実行したり、いくつかの条件を変更してRNA-Seqを実行し、ゲノミクスの疑問に答えるために大量のデータを取得したりできます。
驚くべき真菌の不在とは別に、サンプルのシーケンスは簡単で簡単です。プロジェクトのデータ解析部分は、より複雑になりました。Saca la Lenguaチームは、異なる細菌種のrRNA遺伝子領域を表す、サンプルあたり数百万のリードを取得しました。その量のデータは、どの細菌または真菌種または属が各サンプルに存在するかを判断する上で課題となります。Gabaldón博士は、MiSeqリードをデータベースにマッピングする解析パイプラインを使用し、アライメントの量とシーケンスの類似性を測定するスコアリングシステムを使用しました。これらのスコアにより、研究者は、自分がStreptococcusミュータンスまたは別のStreptococcus種に罹患していたかどうかを述べることができました。
口腔内微生物叢の理解を深める
“私たちはMiSeqデータの品質に非常に満足しています”とGabaldón博士は述べました。これまでの問題は、一般的にDNAの品質によるものでした。MiSeqシステムは、口腔内微生物叢を理解する扉も開けました。“イルミナのシーケンスシステムでは、全ゲノムシーケンスを実行したり、いくつかの条件を変更してRNA-Seqを実行し、ゲノミクスの疑問に答えるために大量のデータを取得したりできます”とGabaldón博士は付け加えました。数年前、それは不可能でした。特定のゲノムについては、大規模なコンソーシアムから公開されているシーケンスデータに頼らなければなりませんでした。イルミナのシステムでは、積極的に行動することができ、特定のゲノムが必要な場合は、自分でシーケンスすることができます。
データ解析が始まったばかりで、Gabaldón博士は、見つけた細菌や真菌の種類、量、または口腔内微生物叢がライフスタイルや健康の変数にどのように関係するかについての情報をまだ持っていません。これは、他の研究者がこのプロジェクトに関心を持つことを妨げるものではありません。“私は研究者からプロジェクトを拡大し、各国で研究を開始することに関心を得ました”とGabaldón博士は述べました。
市民とのつながり
Saca la Lenguaプロジェクトの予期せぬ利点は、教師や学生とつながる能力でした。“スペイン市民に非常に近い場所へ連れて行ってくれたプロジェクトに初めて関わった”とGabaldón博士は述べました。プロジェクトに参加している教師や学生と会い、彼らと話し合って質問に答えました。15歳の学生の聴衆の前で話すことは、会議で科学者のグループと研究について話すよりも困難です。彼らとつながるためには、かなりの努力をする必要があります。
前進する
Gabaldón博士は、これらの検体のシーケンスデータおよびメタゲノミクス研究により、自身や他の研究者が、正常で健康な口腔内微生物叢について、また様々な変数が口腔内微生物の構造をどのように変えることができるかについて、より詳しく知ることができることを望んでいます。これらの洞察は、10代や成人に影響を与えるさまざまな慢性疾患についてより多くの情報を提供する可能性があります。\\"さらに詳しく知ると、微生物叢はクローン病などの疾患や、動脈硬化症など、あなたが考えていない可能性のある疾患に関連していることがわかります。\\"とGabaldón博士は述べました。原則として、つながりがあるかもしれないのは奇妙なことです。しかし、歯を磨くたびに、血流に入る細胞がいくつかあります。その中には、血液中に顆粒を形成して静脈の虚脱を引き起こす可能性のある重大な免疫反応を引き起こす可能性のあるものもあります。すべては、口腔内にどの細菌種が存在するかによって異なります。私たちは、微生物叢が健康状態に影響を与える要因であり、いくつかの重要な疾患の要因である可能性があることを学びつつあります。
また、唾液サンプルは生検よりもはるかに採取しやすいため、口腔内微生物叢にはサンプル採取の利点があることも指摘しています。“サイエンティストが口腔内微生物叢について理解すればするほど、人の健康を改善するためにより多くの研究の機会が開かれます。”Dr. Gabaldónを追加。
イルミナシステムの詳細については、こちらの記事をご覧ください。
MiSeqシステム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html
参考文献
- Saca la Lengua. www.sacalalengua.org. 2016年3月31日にアクセス。