遺伝子発見と細胞モデルを活用して神経発達障害の根底にある遺伝学を理解する

はじめに

オーストラリア在住のLachlan Jolly博士は、アウトドアの魅力をすべて活かしています。Jolly博士は、サイクリング、サーフィン、ハイキング、バスケットボールをしていないときは、神経疾患の原因となる遺伝子を同定し研究するための、同様に広範な研究プログラムに関与しています。Jolly博士は、新しい遺伝子バリアントを発見し、知的障害におけるその役割を説明するために、細胞ベースのモデルを多数の遺伝および機能ゲノム技術と統合しています。

Jolly博士は、アデレード大学のオーストラリア研究評議会フェローとして、神経遺伝学研究プログラムで主導的な役割を果たしています。他のグループでは神経発達障害の根底にある遺伝子変異を同定していますが、Jolly博士は遺伝子変化の影響を発見するための研究を指揮しています。“私たちは、脳の発達にどのような機能的効果を持つ遺伝子変異が備わっているかを知りたがっています”とJolly博士は述べました。ヒトの疾患を引き起こすことは分かっていますが、細胞が行動し、コミュニケーションする方法にどのように影響するかを知りたいと考えています。このグループは、次世代シーケンサー（NGS）を使用して新規変異を同定し、胚性神経発達の細胞培養モデルを使用して、脳の発達と機能に重要な新規遺伝子ネットワークに対する洞察を得ています。彼の最近の研究の一部は、X染色体上の2つの遺伝子（UPF3BとHCFC1）が知的障害に関与しているという発見につながっています。Jolly博士は、忙しいスケジュールの中で、遺伝子発見研究についてiCommunityと話しました。

Q：UPF3BおよびHCFC1遺伝子変異の同定につながった研究研究のきっかけは何ですか？

Lachlan Jolly（LJ）：2009年には、影響を受けた男性が大多数であった知的障害を持つ200を超える家族を対象とした公表済みの研究に貢献し、X染色体が関与している可能性を示しました。このコホートのX染色体上のコーディング領域全体のエクソームシーケンスを行い、原因遺伝子バリアントを発見しました。この大規模なゲノム研究では、UPF3BやHCFC1など、私が現在研究している多くの遺伝子が関わっていました。

UPF3Bで完全な機能喪失型変異を持つコホートのいくつかの家族が発見されました。遺伝学に基づき、UPF3Bが脳の発達に極めて重要な関与をしていることをすぐに知りました。この遺伝子の変異が、罹患した人に見られる異常な脳の発達にどのようにつながるのかを、すぐに解明しました。^{1 , 2}

HCFC1研究は、コホート内に多数の男性が罹患した大規模な多世代家族が存在することを認識したときに開始されました。X染色体の関与は確実でしたが、表現型を説明できるコード領域に原因となるバリアントを見つけることはできませんでした。追加のゲノミクスアッセイによるより広範な検索では、HCFC1遺伝子にノンコーディングバリアントが関与していることが示唆されました。³

Q：異なる種類の細胞株を使用することにより、脳の発達について何を学ぶことができますか？

LJ：多くの場合、in vitro細胞株を用いて新しい遺伝子や遺伝子変異の機能的検査を開始します。これは、変異のスクリーニングを迅速に行い、より高度なモデルが必要かどうかを判断することができるためです。in vitro細胞株では、この物質に簡単にアクセスでき、モデルに合わせて遺伝子的に操作して、素早いリードアウトを得ることができます。

脳細胞に分化する可能性のある発達中の脳幹細胞または胚幹細胞に由来するex vivo培養は、脳発達の代用として使用できることがわかりました。脳の発達の分化やモデル化の可能性がない、または限定的である静的細胞モデルとは対照的に、脳の発達の出来事を再現する細胞培養モデルを選択します。これにより、in vitroで観察されるものと、発達中に患者の脳で起こりうることとの間に相関関係が得られます。この情報により、行動システムや生理システム、脳ネットワークを研究できる、より高度な動物モデルに移行できます。

“これまで遺伝性疾患、特に神経発達性脳疾患と関連したことのない遺伝子を発見しています。”

LJ：UPF3Bは、ナンセンス介在性mRNA崩壊（NMD）経路に関与することが知られています。NMDは当初、mRNAサーベイランスメカニズムとして発見され、早産終止コドンで転写産物を同定し分解します。そのため、すべての遺伝性疾患のほぼ3分の1に関与しており、早産終末コドンによって引き起こされる遺伝性疾患の数は同じです。しかし、NMDパスウェイは主要な遺伝子制御パスウェイとしても認識されており、多くの内因性mRNA転写産物にはNMDを介して制御される特徴があります。コアNMD成分であるUPF1またはUPF2をノックアウトすると、正常なトランスクリプトームの5～10%が脱制御されます。これらの転写産物は、マウス、ゼブラフィッシュ、およびハエモデルで胚致死的な表現型が観察されるため、発生に重要です。対照的に、ヒトにおけるUPF3B変異は致死的ではなく、知的障害を引き起こします。NMDにおけるその役割を考えると、NMDパスウェイは罹患した個人で損なわれている可能性があり、トランスクリプトームが変化する可能性があると仮定しています。

Q：UPF3B変異が脳の発達や知的障害に与える影響は？

LJ：UPF3B変異に起因する知的障害は軽度から重度まで様々で、自閉症、注意欠陥多動性障害（ADHD）、統合失調症などのその他の行動問題が含まれる可能性があります。これまでに研究した、影響を受けた個人の表現型スペクトルを特定しました。表現型のばらつきは、同じUPF3B変異を持つ2人の兄弟がいる1つの家族内でも存在し、1人の兄弟は重度の知的障害を持ち、もう1人の兄弟は軽度の影響を受けていました。

UPF3B変異による疾患転帰を修飾する可能性のあるメカニズムを発見しました。UPF3B遺伝子にはパラログUPF3A。UPF3B機能がない場合、UPF3Aは部分的に冗長に機能し、UPF3Bに取って代わってステップインします。軽度に罹患した兄弟では、UPF3Aの発現が重度に罹患した兄弟姉妹と比較して高いことがわかりました。これは、他のUPF3B変異を持つ人に見られる傾向です。現在、UPF3A機能が疾患転帰の修飾因子となる可能性があるかどうかを系統的に検査しています。研究を通じて、UPF3Bの欠損が、発達中の脳の原始細胞の動作に変化をもたらす方法でトランスクリプトームを変化させることを示すエビデンスが得られました。現在、UPF3A機能がこれらの欠陥を救出できるかどうかをテストしています。

“イルミナのテクノロジーは、未診断の神経発達障害の症例の背景にある遺伝学を理解するために非常に重要です。”

Q：HCFC1を見つけるためにノンコーディング領域を調べたきっかけは何ですか？

LJ：多くの罹患男性を持つ大規模な多世代家系のサンプルを評価し、X染色体上のすべてのコーディング領域をスクリーニングしてバリアントを見つけました。しかし、コーディングバリアントは見つかりませんでした。

次に、連鎖解析を行い、罹患した個人で共有され、罹患していない男性では共有されない染色体の部分を特定しました。これにより、108の遺伝子しか含まれていないX染色体の小さな領域に焦点を合わせることができました。イルミナゲノムアナライザーシステムを用いて、これらの遺伝子周辺のすべてのコーディングシーケンスと制御シーケンスをシーケンスし、非常に高いカバレッジを実現し、塩基対あたり平均100リード以上を獲得しました。その領域にバリアントがないことを再び発見したとき、コーディング領域外をさらに調べました。遺伝子間領域の高度に保存された転写因子結合部位に影響を与える興味深いノンコーディングバリアントを発見しました。ノンコーディング変異は、通常はHCFC11発現を抑制するYY1と呼ばれる転写因子の結合を喪失させます。

Q：正常な脳の発達におけるHCFC1の役割をどのように発見しましたか？

LJ：HCFC1自体が転写コアグルーターであるため、我々は、その関与をさらに暗示する可能性のある転写変化を患者さんで特定できるかどうかを調べました。リンパ芽球様細胞株と呼ばれる患者由来の血液細胞株を用いてHCFC1を研究しました。これらの細胞株は血液由来ですが、その転写特性はニューロンや脳の支持細胞と重複しているため、脳内で起こっている可能性のあることの代用として機能することができます。リンパ芽球系細胞株を用いて、HCFC1が過剰発現しており、これは他の約200の遺伝子の脱制御と関連していることがわかりました。遺伝子オントロジー解析により遺伝子を解析することで、HCFC1の関与をさらに裏付け、ミトコンドリアやクロマチンの制御など、HCFC1が制御することが既に知られているプロセスを特定しました。さらに重要なのは、遺伝子腫瘍学解析により、HCFC1と神経細胞の発生と分化が関連していたことです。そこから、脳の発達におけるHCFC1過剰発現の役割を発見するために、HCFC1過剰発現の影響をモデル化することにしました。

Q：HCFC1をどのようにモデル化しましたか？

LJ：遺伝子オントロジーパスウェイでは、HCFC1が前脳の発達に関与していることが示されました。胚性マウス前脳からニューロンと神経幹細胞を単離し、in vitroで培養しました。これによって、それらを操作して、疾患のモデルを作成しようとしました。患者由来細胞株と同様に、HCFC1を過剰発現し、これが神経細胞の挙動にどのように影響するかをモニタリングしました。HCFC1は正常な細胞挙動に強力な影響を及ぼしました。ニューロンは軸索および樹状突起の増殖が抑制され、ニューラル幹細胞で過剰発現すると、細胞周期から出て星状細胞に分化します。この結果、HCFC1の過剰発現をもたらしたHCFC1の上流のノンコーディング変異が、ヒトの脳がin vivoで発達する方法に影響を及ぼす可能性があるという裏付けとなるエビデンスが得られました。

当社の機能研究は、脳の発達のどの細胞タイプまたは側面が影響を受けるかを示し、新しい治療標的や治療法の発見につながる可能性があります。

Q：HCFC1の過剰発現は知的障害にどのようにつながるのか？

LJ：今のところ答えるのは難しいです。インビトロで見ているものと脳の構造から導き出せるものとを結びつけるのに十分な情報がありません。患者は脳の構造を調べるための詳細なMRI解析を行っていません。神経幹細胞の増殖方法に変化がある場合、表現型の相関関係は、細胞周期から抜け出す場合は小頭症、神経幹細胞に増殖能力が余分に備わっている場合は大頭症になると仮定できます。私たちが知らない脳の奇形部位が存在する可能性がありますが、これはin vitroで見られるものと一致します。ニューロン細胞の結合やコミュニケーションの欠陥など、より微妙な影響があるその他の要因が寄与している可能性があります。脳疾患におけるHCFC1の役割をよりよく理解するには、遺伝子改変マウスなどのより高度なモデルが必要です。

Q：研究で使用するテクノロジーをどのように決定しますか？

LJ：関与していると思われる遺伝子が見つかった場合、その遺伝子について分かっていることが指針となります。UPF3BとHCFC1はどちらも遺伝子発現を調節する遺伝子です。UPF3BはmRNAの減衰メカニズムの一部であり、HCFC1は転写コアグルレーターです。トランスクリプトームが影響を受ける可能性があることを知って、RNA-Seqを使用して、これらの特定の変異が患者由来細胞株のトランスクリプトームにどの程度影響するかを解析しました。この情報が脳の発達のあらゆる側面に関わる場合、in vitro神経細胞モデルシステムを使用して変化を探すことができます。これら2つの遺伝子の場合、このアプローチは非常に成功しました。

Q：イルミナのシーケンスシステムとアレイは、どのように研究を可能にしますか？

LJ：遺伝子探索のためにHiSeq 2500システムでエクソームシーケンスを行います。全ゲノムシーケンスにはHiSeq X Tenシステムを使用し、イルミナアレイを使用してリンケージと遺伝子座マッピングを実行します。イルミナのテクノロジーは、未診断の神経発達障害の症例の背景にある遺伝学を理解するために非常に重要です。これにより、新しい遺伝子を発見することができ、その後、細胞ベースのモデルで機能研究を実施することでさらに解析することができます。

HCFC1プロジェクトでは、HiSeq 2500システム上のRNA-SeqとHumanHT-12 v4 Expression BeadChipを用いてトランスクリプトームプロファイリングを実施しました。このアレイは、qPCRおよびRNA-Seqデータと良好な一致性を示すため、選択しました。

UPF3Bプロジェクトでは、RNA-SeqとHumanOmni BeadChipsを使用して、患者細胞株内のコピー数バリアントを解析しました。コピー数バリアントの研究は、各個人が独自のゲノム変化を持っているため重要です。遺伝子発現の変化がコピー数の増加または減少と相関できるかどうかは、私たちが研究に関心を持っていたことでした。具体的には、UPF3B変異のある個体におけるトランスクリプトームの変化が、NMDの欠損によるものか、または個人のコピー数バリアントによるものかを把握したいと考えました。

“横に疑問符が付くバリアントは数多くあります。機能の割り当てプロセスを支援するには、研究に基づく環境においてNGSを使用する必要があります。

Q：UPF3BとHCFC1を用いた研究結果はどのようにヒトの健康を改善できるでしょうか？

LJ：これまでに遺伝性疾患、特に神経発達性脳疾患と関連したことのない遺伝子を発見しています。さまざまな公開データベースで発見したものの表現型と遺伝子型を公開すると、研究努力と臨床診断の両方に影響を与える知的障害の潜在的な原因をまとめて理解するのに役立ちます。これらの症例をさらに強調することで、これらの遺伝子の変化に影響を受ける他の患者のための診断検査やソリューションにつながることを願っています。

新しい治療法の開発に貢献するという点で、私たちはさらに遠くにいます。当社の機能研究は、脳の発達のどの細胞タイプまたは側面が影響を受けるかを示し、新しい治療標的や治療法の発見につながる可能性があります。例えば、UPF3Aと、UPFUPF3B変異の転帰を修正する上でのその潜在的な役割について、継続的な調査を行っています。しかし、治療戦略の開発と科学的検査は、多くの場合、数年または数十年かかるプロセスです。これらの新たに発見された遺伝子の研究は、今から始まっています。

Q：NGSは今後、あなたの研究にどのような影響を与えると思いますか？

LJ：NGSは、主に研究ベースのツールから臨床診断における一般的な手法へと発展しました。そのため、多くの新しい遺伝的バリアントが同定されていますが、これは、意義不明のバリアントに機能を割り当てるという大きな課題を伴います。大規模なデータセットとコホートを一緒に比較できます。これにより、それがどの程度稀であるか、または同様の表現型を持つ患者に以前に発見されたことがあるかなど、重要性を割り当てる上でいくつかの有用性が得られます。しかし、横に疑問符が付くバリアントは数多くあります。研究で行ったように、より多くの研究に基づく環境でNGSを使用することは、機能の割り当てプロセスを支援するために必要です。例えば、NGSが適している当社のUPF3BおよびHCFC1患者細胞株におけるトランスクリプトームのインテロゲーションは、その関与の証拠を提供し、発生、細胞、分子のメカニズムの同定に役立つ神経細胞ベースの研究の指針となりました。NGSテクノロジーは、間違いなく重要な役割を担っており、臨床診断や研究に焦点を合わせた疑問に答えるために、ハイスループットやサンプルのハイデプス解析に対するニーズが高まっています。