神経多様性のマッピング：マウス一次視覚皮質におけるニューロン同一性の分子解析

はじめに

アメリカの未来学者、物理学者、作家であるMichio Kaku氏は、「ヒトの脳には1,000億のニューロンがあり、1個のニューロンは他の10,000のニューロンとつながっている。あなたの肩の上にあるものは、既知の宇宙の中で最も複雑な物体だ」と書いています。彼の言葉は誇張ではありません。実際、今のところ、科学者はマウスのように比較的単純な哺乳類の脳でさえ、どれほど多くの異なる種類のニューロンが存在するのかを明らかにできていません。ましてやヒトの脳は言うまでもありません。

脳の内的な仕組みを理解することを目的とした独立系の非営利研究機関であるAllen Institute for Brain Scienceは、それを変えようとしています。Allen InstituteのCell Typesプログラムの研究者であるBosiljka Tasic（PhD）は、マウス視覚系におけるニューロン同一性を定義するため、先駆的な分子解析手法を開発し、個々のニューロンのトランスクリプトームとエピジェネティックランドスケープを解析しています。彼女は、Allen Instituteの使命や、Illuminaのシーケンシングシステムを用いたシングルセルシーケンスがいかにニューロンの分類の取り組みを変革しているかについて、iCommunityに語りました。

Q：Allen Institute for Brain Scienceの使命は何ですか？

Bosiljka Tasic（BT）：Allen Instituteの使命は、ヒトの脳の仕組みの理解を加速させることです。この野心的な使命に向けてインパクトを生み出すために、マウスの脳を構成する多種多様な細胞の中で、情報がどのように符号化され、処理されているかを研究しています。マウスは最も利用しやすい哺乳類のモデルシステムであり、情報処理の原理の多くは哺乳類間で変化していません。計画では、マウスの視覚系を研究して基本的な情報処理の枠組みを定義し、その後、霊長類やヒトと比較して、人間に固有のものを理解することを目指します。

これを達成するために、私たちは一般的な学術研究室とは異なる組織構造と規模を有しています。私たちは、異なる専門知識を持つ多くのサイエンティストを集め、真に学際的な形で、重複する部分を持つ複数のチームとして組織しています。また、これらの研究から得られる一次データを、百科事典的なリソースとして、私たちのウェブサイトでコミュニティーに提供しています。私たちの最新のリソースの1つは、この脳領域を構成する個々のニューロンの遺伝子発現データ、生理学、形態を含め、マウス一次視覚皮質（V1またはVISpとして知られる）の細胞タイプに焦点を当てています。

Q：V1を構成する細胞の種類は何ですか？

BT：V1は、視覚情報を処理する皮質の主要領域です。この皮質領域内の細胞多様性の程度についての私たちの理解は限られていました。主なタイプは、興奮性ニューロンと抑制性ニューロン、非ニューロン細胞で、さらにこれらの各主要カテゴリー内のさらなる細分類について把握していました。皮質は多くの人々によって研究されていますが、細胞の多様性や、単一細胞レベルにおける異なる種類の情報の相関関係を包括的に説明するものは存在しませんでした。ほとんどの研究は、通常、複数のパラメーターに基づいており、高度な多次元データセットには基づいていませんでした。例えば、3つの遺伝子を使用して細胞を分類すると、ひとつの像が得られることがあります。しかし、すべての遺伝子を見ると、全く異なる見解が得られる可能性があります。

「シングルセルmRNAシーケンスを使用して、1細胞あたり数千の遺伝子を検出し、すべての細胞について高度な多次元データセットを取得できます。」

Q：シングルセルトランスクリプトームシーケンスがこれらの研究にとって貴重なツールとなるのはなぜですか？

BT：シングルセルトランスクリプトームシーケンスが有利な理由はいくつかあります。これは全ゲノムな手法であり、細胞に発現するすべての遺伝子を最も適切に近似して解析します。多くの遺伝子に基づく細胞の多様性を捉えることができます。シングルセルmRNAシーケンスを使用して、細胞あたり数千の遺伝子を検出し、すべての細胞について高度な多次元データセットを取得できます。それ以前は、多くても2つ程度の遺伝子に基づいて細胞を特徴づけていました。たまたま重要な遺伝子に注目していたのであれば、それで十分かもしれません。しかし、重要な遺伝子が何であるかはわかっていませんでした。

Q：シングルセルmRNA-Seqを使用して、V1ニューロン細胞についてどのようなことを発見しましたか？

BT：私たちがシングルセルmRNA-Seq研究を始めたときは、何が見えてくるのかはわかっていませんでした。トランスジェニックマウスのV1から、品質管理基準に合格し良好なシーケンス情報を持つ細胞を約1,700個収集しました。V1皮質領域では49のタイプを定義することができ、42のタイプがニューロン、7つのタイプが非ニューロンでした。¹ 42のニューロンタイプのうち、約半分がGABA作動性ニューロン、残りの半分がグルタミン酸作動性ニューロンであることがわかりました。

この細胞分類解析の長所は、偏りがないことです。このシングルセルデータセットをクラスター化して分解した際、V1のどこから細胞が来たのか（どの細胞層とどのトランスジェニック系統か）はわかりませんでした。2つの並列クラスター化アプローチを行い、さらに検証のための第3の解析段階を設けることで、特定された遺伝子発現シグネチャーに基づき各単一細胞を細胞型へとどの程度堅牢に分類できるかを評価しました。既知のマーカー遺伝子または新しいマーカー遺伝子に基づいて、興奮性、抑制性、または非ニューロン性のアイデンティティタイプを事後的に割り当てました。

Q：ファジーと特徴付けたクラスターがいくつか見つかりました。それは何を意味し、どのような意味合いがあるのでしょうか？

BT：バイオインフォマティシャンと仕事をする際、細胞タイプについて得られた遺伝子発現シグネチャーを調べ、すべての細胞についてこれらのタイプのいずれにどの程度一致しているかを確認したいと考えました。反復的な機械学習アプローチを使用するこの調査では、特定の細胞があるクラスターに分類されることもあれば、別のクラスターに分類されることもあることが示されました。私たちはこれらを「中間」細胞と呼んでおり、通常の研究論文では見られないような視点を提供してくれます。これらは、曖昧なアイデンティティを持つ細胞であり、特定の細胞タイプに多く見られます。一部のクラスターは、多くの中間細胞によって「接続」されています。それ以外のクラスターは、この多次元遺伝子発現空間で単独の位置を占めており、それらと他のクラスターの間に中間細胞はありません。

これらのデータから、すべての細胞タイプが厳密に離散したアイデンティティを持つわけではないことが示唆されます。一部の細胞タイプは明確に分離できない可能性があり、実際には表現型の連続体の一部である可能性があります。これは神経科学では目新しい概念ではありません。ニューロンは活動や経験に応じて変化し、動物の生涯にわたって行動を変化させるのに必要な可塑性を持つことが分かっています。

「NGSでは、これまでに発見されなかった新しいマーカーを多数同定し、その発現をその後別の方法で確認しました。」

Q：トランスクリプトームの解析のために以前に使用していた技術は何ですか？

BT：次世代シーケンサー（NGS）と並行してqRT-PCRを行いました。しかし、qRT-PCRの問題は、どの遺伝子を調べたいかが必ずしもわからないことです。全ゲノムではない方法の問題は、遺伝子の選択に膨大な時間を費やしても正しい答えが得られないことがあるということです。全ゲノムな事前知識に基づいて遺伝子選択を行わないと、選択にバイアスがかかり、完全なトランスクリプトームランドスケープをうまく表現できなくなります。

mRNA-Seqは、全ゲノムな遺伝子発現プロファイルを提供し、トランスクリプトームランドスケープにおける区分を最もよく示す遺伝子を特に選択することができます。中には以前から知られていた遺伝子もありましたが、個々のニューロンタイプの最良のマーカーとして現在使用している遺伝子の多くは、NGSで同定するまでは知られていませんでした。その代わりに、文献で報告されている遺伝子を使用しましたが、すべての手法にはそれぞれ感度の問題があるため、多くの遺伝子は試験されなかったか、あるいは検出されませんでした。NGSでは、これまでに発見されなかった新しいマーカーを多数同定し、その発現をその後別の方法で確認しました。

Q：細胞単離はどのように行いましたか？

BT：細胞単離は大きなハードルでした。成体の神経系組織は懸濁液に解離しにくいため、成体の生きたニューロンの単離は困難です。細胞は高度に相互接続されており、細胞単離プロセスでは軸索と樹状突起が断裂し、多くの細胞は崩壊してしまいます。さらに、一部の希少細胞タイプにアクセスするには、多くの細胞をプロファイリングする必要があります。そのため、私たちは、特定の細胞群が蛍光タンパク質で標識されるトランスジェニックCreラインを細胞源として使用することにしました。次に、成体脳の細胞懸濁液を作製するための手順を最適化し、シングルセル単離のための蛍光活性化セルソーティング（FACS）を確立しました。これらの手法により、希少な細胞集団を単離することが可能になりました。偏りのない方法よりも高い頻度で希少な細胞型をサンプリングできたのです。したがって、細胞サンプリングは偏りのないものではありませんでしたが、希少な細胞型を標識できるトランスジェニック系統から細胞を意図的に選択し、単離しました。このアプローチを用いて、非常に信頼性の高いシングルセル単離を実現しました。

BT：当研究室ではMiSeqシステムを用いた比較的浅いシーケンシングにより、ライブラリーの検証シーケンシングを実施しました。その後、HiSeqシステムを持つ地域内の複数のコアラボに、より深いライブラリーシーケンスを委託しました。

「MiSeqシステムを自施設に導入したことで、手法の迅速な開発や変更が可能になりました。また、HiSeqシステムを用いた詳細なシーケンス解析のためにコアラボへ送付する前に、良質なライブラリーが作成できていることを確認できるようになりました。」

Q：MiSeqシステムを選んだ理由は何ですか？

BT：研究室内で迅速に結果が得られるシステムが必要でした。特に、プロセスの開発中にライブラリー検証を実施するためにです。MiSeqシステムを自施設に導入したことで、手法の迅速な開発や変更が可能になりました。また、HiSeqシステムを用いた詳細なシーケンス解析のためにコアラボへ送付する前に、良質なライブラリーが作成できていることを確認できるようになりました。それは私たちにとって良い組み合わせでした。

Q：どのようなライブラリー調製キットを使用していますか？

BT：いくつかのアプローチをテストし、単一細胞からのサンプルを確実に増幅できるClontechのSMARTerを選択しました。V1試験では、SMARTer Version 1を使用しました。現在はSMART-Seq 4が利用可能で、新たな研究に使用しています。SMARTerで得られたcDNAからのライブラリー調製には、Nextera XT Library Prep Kitを使用しました。これにより、少量のcDNAをNGSライブラリー調製に使用することができ、またソニケーションを省略できるようになりました。

「単一細胞トランスクリプトーム解析が行われるまで、不均一な組織を採取し、その中の分子型を偏りなく定義する方法はありませんでした。」

Q：シーケンスランのパラメーターは何ですか？

BT：新しい細胞型を区別する際に、適切な解像度を得るために必要な深度がわからなかったため、最初はシーケンス深度を大きめに設定しました。早期のシングルセルサンプルから約2,000万～3,000万リードまでcDNAのシーケンスを行い、時にはさらに高いレベルにしました。次に、リードのサブサンプリングとクラスタリングをin silicoで行い、ほとんどの細胞について、細胞あたり500万～1,000万のトータルリードを得ることで十分であると判断しました。

ニューロンと非ニューロンを区別し、興奮性細胞と抑制性細胞を区別したい場合、このような深度は必要ありません。これらの研究では、はるかに低い深度を使用できます。細胞あたり10万リードやそれ以下でも十分です。しかし、関連するニューロンのサブタイプを入手できた細胞数で区別したい場合、もっと深いシーケンスがどうしても必要でした。

Q：シングルセルシーケンスでは、他のアプローチでは見えないどのような情報が明らかになりましたか？

BT：シングルセルシーケンスは、細胞タイプの分類に寄与しており、それは皮質に限ったことではありません。単一細胞トランスクリプトーム解析が行われるまで、不均一な組織を採取し、その中の分子型を偏りなく定義する方法はありませんでした。シングルセルトランスクリプトミクスでは、最初にどの遺伝子を使用すべきかを尋ねることなく、組織をタイプに分解することができます。代わりに、すべての遺伝子を調べることができます。

シングルセルシーケンスの前には、異なる細胞タイプの十分に包括的な一覧を何が構成するのかも分かっていませんでした。何千種類もあるのか？ 規模はどのくらいなのか？ 研究から見えてきたのは、50種類のV1細胞タイプがあるということ、そしてその中には境界があいまいなものもあるかもしれない、ということです。私たちの研究が本当に包括的であるとは言えません。また、同定できなかった希少な細胞タイプがあるかもしれません。そのため、最終的にこの脳領域にはさらに数十種類が存在する可能性があります。

最後に、シングルセルシーケンスにより、特定の細胞タイプに特異的なマーカーを定義できるようになりました。これは、これらの特定のタイプにアクセスできるツールを構築する上で非常に大きな意味を持ちます。私たちはレシピを手に入れたのです。例えば、「遺伝子Aと遺伝子Bを組み合わせれば、細胞タイプZに特異的にアクセスできる」といった具合です。以前は推測するだけでした。これらの新しいツールにより、異なる細胞タイプの機能を定義し、神経回路内でどのように機能するかを調べることができます。

「異なる皮質領域からのシングルセルmRNA-Seqデータを比較することで、細胞タイプの保存と独自性に関する新しい質問をすることができます。」

Q：研究の次のステップは何ですか？

BT：我々の研究は、ある意味パイロット研究でした。明確に定義された解剖学的領域で成体皮質細胞を用いてシングルセルmRNA-Seqを実施できることが示されました。今後は、他の明確に定義された領域、とりわけ他の皮質領域のプロファイリングを行いたいと考えています。異なる皮質領域からのシングルセルmRNA-Seqデータを比較することで、細胞タイプの保存と独自性に関する新しい質問をすることができます。

外部の学術研究室といくつかの協力関係があり、それぞれの研究室が注目する脳領域の細胞を分類するために、私たちのアプローチを採用しています。この手法を使用すると、V1とは大幅に異なる機能的役割を持つ可能性のある脳の領域を分解することができます。特定の遺伝子ツールを構築することで、研究したい特定の行動における特定の細胞型の機能が何であるかを調べることができます。とても期待しています。

MiSeqシステムは販売終了となりました。MiSeq i100システムを代替製品として推奨しています。

HiSeq 2500システムは販売終了となりました。NovaSeq Xシリーズを代替製品として推奨しています。

Single-Cell RNAシーケンス

Nextera XT DNA ライブラリー調製キット

参考文献