UK Laboratory、SNPアレイを使用して細胞遺伝学解析を迅速化し、強化

はじめに

英国のニューカッスル・オン・タイン病院のNorthern Genetics Serviceで約30年のキャリアを積んだ^1人の臨床細胞遺伝学者、Simon Andrew Zwoliński博士は、幅広い細胞遺伝学技術を使用してきました。主に出生後のサンプルを扱うため、彼は方法論における適時性と正確性の必要性に敏感です。*

Zwoliński博士は、常に自分のアプローチと仕事で使用するテクノロジーの進化にオープンな姿勢で取り組んできました。Gバンドと蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を使用してキャリアをスタートさせ、細菌人工染色体（BAC）比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）アレイ、そしてオリゴアレイに移行しました。2015年には、SNPベースのアレイに興味を持つようになりました。イルミナCytoSNP-850K BeadChipをAgilent CGH + SNPおよびAffymetrix CytoScan SNPアレイと比較した後、彼はInfinium CytoSNP-850K BeadChipを選びました。彼のチームはNextSeq ® 550システムでアレイを検証し、1か月でCytoSNP-850K BeadChipの使用にスムーズに移行しました。

iCommunityは、Zwoliński博士と、CytoSNP-850K BeadChipの有益な品質と、それがチームの効率をどのように向上させたかについて話しました。

Simon Andrew Zwoliński博士は、英国のニューカッスルにあるTyne Hospitalsのニューカッスル北部遺伝学サービスで、出生後の細胞遺伝学およびアレイの責任者です。

Q：遺伝学に興味を持ったきっかけは何ですか？

Simon Andrew Zwoliński（SAZ）：私は元々、植物育種と作物の進化を専門とする植物学者としてトレーニングを受けていました。その後、バーミンガムで応用遺伝学の理学修士号を取得し、ロンドンのインペリアルカレッジで純粋な遺伝学の博士号を取得しました。Ascobolusの浸漬におけるマイオティック分離パターンを予測する能力に興味を抱きました。

Q：キャリアを通してテクノロジーのあらゆる変化を体験することはどのようなことですか？

SAZ：キャリアをスタートさせたとき、それはすべてメンデル遺伝学でした。その後、DNAシーケンスの同定を開始し、ヒトゲノム全体のシーケンスが終わった直後に、これは診断遺伝学に多大な影響を与えました。細胞遺伝学は、光学顕微鏡下で小さな変化を探し求める“違いを突き止める”ようなものでした。今日、細胞遺伝学はコンピューターベースであり、コピー数の変化の実際の遺伝子コンテンツを解釈しています。ほとんどの臨床サイエンティストは、現在メンデル遺伝学についてさえ考えておらず、私はそれについて少し悲しい思いをしています。

Q：次世代シーケンサー（NGS）などの新しいテクノロジーは、これまで知られていなかった遺伝性症候群に関連するバリアントの同定にどのように役立っていますか？

SAZ：NGSは病原性遺伝子と関連する表現型を特定したため、アレイの解釈にその情報を使用できるようになりました。

Q：これらの発見のスピードは、過去数年間で増加しましたか？

SAZ：発見のスピードは飛躍的に向上しています。2006年にアレイを初めて実行した時期を特定できる症候群が約20件ありました。現在、アレイで特定できる500の症候群に向けられていますが、その一部はまだ名前が付けられていません。

Q：現在、ラボではどのような細胞遺伝学的検査を実施していますか？

SAZ：現時点では、バランスの取れた再構成を探し、細胞遺伝学的検査にFISHと数種類の染色技術を使用するため、Gバンドを引き続き実施しています。しかし、現在、私たちの仕事の大半はSNPアレイに関するものです。

Q：これまで使用してきたさまざまな細胞遺伝学的検査テクノロジーの利点と欠点は何ですか？

SAZ：私が1988年に始めたとき、私たちが利用できたのはGバンドとCバンドという手法だけでした。全ゲノムのスクリーンでしたが、取り込んだ情報では目立つものでした。約5メガ塩基の解像度を検討していました。異常の同定率は5%未満でした。FISHに進むと、サンプルが特定の症候群を示しているかどうかを知ることに限定されました。FISHは、“はい”または“いいえ”以外の情報を提供しません。

そして、すぐに登場し、進歩した他の多くのテクノロジーとも連携しました。1つはM-FISHと呼ばれ、各染色体に異なる色を割り当てたため、Gバンドによって見えない転座が見えました。また、テロメアの再構成のためにマルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（MLPA）も試みました。

2006年にBACアレイの使用を開始し、2010年にオリゴアレイに移行しました。2016年にはSNPアレイに移行し、異常を判断するための最も強力で正確なアレイとなりました。これまでの経験から、Gバンディングを使用して異常を発見する確率は20分の1であることがわかりました。新しいテクノロジーが導入されるにつれ、異常を検出する可能性は高まりました。CytoSNP-850Kアレイでは、4サンプル中1サンプルに対する答えが見つかりました。これは大きな違いです。

Q：オリゴCGHアレイでは実現できないSNPアレイとは？

SAZ：オリゴアレイとBACアレイはコピー数の変化しか識別できませんが、SNPアレイは、片親ジソミー（UPD）、ヘテロ接合性の喪失、ヘテロ接合性の欠如などのコピー中立的な変化を特定できます。SNPアレイは強力なツールであり、追加情報を得るために余分な作業は必要ありません。

"CytoSNP-850Kアレイは非常に良好で、信頼性と一貫性が非常に高く、わずか4週間で移行を完了しました。"

Q：どのようなSNPアレイを検討しましたか？

SAZ：Agilent、Affymetrix、イルミナを含むすべての市販SNPアレイサプライヤーを調べました。CytoSNP-850K BeadChipは、解像度、デザイン、コストの点で最高のプラットフォームだと考えたため、これを採用しました。また、イルミナは過去の経験から信頼でき、会社と良好な関係を築いていたことも分かっていました。

私たちの判断のもう1つの要因は、SNPアレイの解析に使用するBlueFuse ® Multi Softwareがすでに身近であったことです。ソフトウェアは高品質で非常に使いやすいため、これは重要なセールスポイントでした。

Q：CytoSNP-850K BeadChipへの移行をどのように行いましたか？

SAZ：CytoSNP-850K BeadChipに切り替えると決めた時、約3カ月間のミーティングを行い、オリゴからSNPアレイに移行するのが良い決断であると、当研究所のマネージャーを説得しました。

アレイプラットフォームの検証には約8週間かかり、オリゴアレイとSNPアレイを同時に実行するにはさらに4週間かかると推定しました。移行を行い、チームをトレーニングするのに必要な時間だと思いました。しかし、CytoSNP-850Kアレイは信頼性と一貫性が高いため、わずか4週間で移行を完了しました。2016年2月にはオリゴアレイを使用し、2016年3月初めにはSNPアレイのみを使用していました。

"現在、オリゴアレイでは同定できなかったSNP異常をピックアップしています。"

Q：CytoSNP-850K BeadChipをどのように検証しましたか？

SAZ：CytoSNP-850Kアレイを検証するために、32の過去の異常サンプルを測定しました。いずれの場合も、SNPアレイは異常を拾うだけでなく、オリゴアレイよりもはるかに正確にブレークポイントを決定することができました。異常の大きさはすべて、オリゴアレイから推定した最小値と最大値の間にありました。データはSNPアレイを検証し、オリゴアレイがもともとさまざまなサイズを提供するという点でどの程度優れているかを示しました。

これら32のオリジナルサンプルを選んだ際、欠失、重複、および三重化を含む、さまざまな遺伝子異常を示すことを確認しました。また、ヌリソミー、トリソミー、非常に小さな異常があるサンプル、および男性と女性の被験者の両方に既知の性染色体異常があるサンプルも選択しました。時には、32のサンプルでも、オリゴアレイから得られた情報よりも多くの情報を発見することがあります。オリゴアレイで単純に見えるコピー数の変更の一部は、CytoSNP-850Kアレイでより複雑であることがわかりました。

Q：CytoSNP-850K BeadChip検証研究にどのような組織タイプを使用しましたか？

SAZ：主に血液を使用し、悪性腫瘍サンプルについても検証を行いました。特に、この2つのテクノロジーを用いたがん遺伝子の増幅がどのようなものかを調べました。さらに、胎盤サンプルの一部を解析しました。ここでは、母細胞が汚染されていることがわかっており、CytoSNP-850K BeadChipによって容易に回収されました。また、出生前サンプルの一部を分析し、この技術が日常的に使用するすべての組織タイプで機能することを確認しました。

Q：検証研究にはどのくらいの時間がかかりましたか？

CytoSNP-850K BeadChipは非常に良好で、精度と正確さで遺伝子異常を特定できたため、アレイの検証に3週間しか費やしませんでした。オリゴアレイとSNPアレイは2～3週間並行して実行されましたが、CytoSNP-850K BeadChipデータに非常に自信があったため、オリゴはほとんど確認されませんでした。

オリゴスライドと試薬のいくつかは、必要になった場合に備えて保存しました。最後に、もう使用しないことに気付いたため、オリゴアレイをまだ実施している別のラボに提案しました。現時点では、オリゴアレイの使用に戻るつもりはありません。

Q：NextSeq 550システムおよびCytoSNP-850K BeadChipの運用に慣れるまで、トレーニングにはどのくらいの時間がかかりましたか？

SAZ：イルミナのスタッフは素晴らしく、実践的なセットアップと解析を行うために2週間かけてトレーニングを受けました。私たちのチームがワークフローにどれだけ迅速に取り組めたかは驚くべきことでした。問題は発生しておらず、ここ数か月でチーム全体のトレーニングを行いました。

CytoSNP-850K BeadChipへの移行を成功させる大きなメリットは、必要なハンズオン時間の削減です。CytoSNP-850K BeadChipでは、週に64～128のサンプルを分析しています。オリゴアレイでこの多くの解析を実行しようとしていたら、人的能力は得られませんでした。週にわずか64サンプルであっても、オリゴアレイで解析を行うのに少なくとも3人を要したでしょう。

"イルミナのスタッフは素晴らしく、実践的なセットアップと解析を行うために2週間かけてトレーニングを受けました。私たちのチームがワークフローにどれだけ迅速に取り組めたかは驚くべきものでした。"

Q：CytoSNP-850K BeadChipの結果は、解像度の面でaCGHの結果と比較してどうですか？

SAZ：2つのテクノロジーの違いは大きく異なります。International Standard of Cytogenomics（ISCA）v2オリゴアレイデザインのため、多くの症候群は十分にカバーされませんでした。SNPアレイの肯定的な点の1つは、既知のすべての症候群を含むように設計されており、すべてのターゲット遺伝子がカバーされていることです。現在、オリゴアレイでは同定できなかったSNP異常をピックアップしています。

Q：オリゴアレイとSNPアレイの間でDNA濃度要件に違いはありましたか？

SAZ：違いはありますが、私たちには影響がありません。以前は、オリゴアレイのDNAのクリーンアップに多くの時間を費やしていましたが、今はそうする必要はありません。CytoSNP-850K BeadChipでサンプルがロボットから出てくるのとまったく同じように処理しているため、作業と時間を大幅に節約できます。その結果、ターンアラウンドタイムが短縮されました。

Q：CytoSNP-850K BeadChipでヘテロ接合性の喪失を検出できますか？

SAZ：CytoSNP-850K BeadChipは、コピー数の変更とコピー中立的変更をより正確に決定することができます。アレル頻度とヘテロ接合性に関する詳細な情報を得ることは有用です。SNPアレイは、log R比で確認できる欠失または重複がある場合に、組み込みの確認を提供します。オリゴアレイでサンプルを解析していたとき、ソフトウェアによるコールのほとんどが現実ではないことに気づきました。私たちの被験者コホートで何回訪問を見たかに基づいて、それらは現実的ではないと推測する必要がありました。今日SNPアレイを実施すると、Bアリル頻度によってそれが現実的かどうかがわかり、結果に自信が持てます。さらに、一部の症候群領域ではCytoSNP-850K BeadChipに100以上のアレイ機能がありますが、オリゴアレイにはわずか3つまたは4つの機能しかありません。

Q：CytoSNP-850K BeadChipとオリゴアレイでは、増幅やモザイク現象の検出に違いはありますか？

SAZ：オリゴアレイを使用する場合、理論上のlog 2比は重複の場合は+0.6、欠失の場合は-1.0と予想されます。しかし、これは理論値に過ぎず、常にある程度の変動がありました。時には、+0.6または-1.0ではなく、モザイク現象の手がかりとなるlog 2比が得られることがありますが、FISHによってのみ確認することができます。これで、B対立遺伝子頻度の偏差によって、モザイク現象と複数のコピーを明確に認識できるようになりました。

どの程度のモザイク現象が正確に検出できるかはわかりませんが、10%未満の欠失レベルを同定したと推定します。重複すると、モザイク現象の検出ははるかに困難になり、約20%のレベルが見えるようになると思います。複数のコピーの場合、B対立遺伝子頻度チャート内の異なるパターンを見ると、その数を確認できます。

"CytoSNP-850K BeadChipでは、週に64～128のサンプルを分析しています。オリゴアレイでこの多くの解析を実行しようとしていたら、単純に人手は持たないでしょう。"

Q：CytoSNP-850K BeadChipへの移行について、何か懸念がありましたか？

SAZ：CytoSNP-850K BeadChipに移行した時に心配していたことの1つは、コール数の増加でした。実際には、コールの数はオリゴアレイで得られた数と変わりません。違いは、CytoSNP-850K BeadChipでは、ほぼすべてのコールが現実であることです。良性または病原性のいずれであるかは、通常、有意な遺伝子やエクソンがない場所に良性または病原性が存在するため、簡単に判断できます。

SNPアレイは、Prader-Willi、Russell Silver、Beckwith-Wiedermannなどの一部の症候群に対してUPDまたはヘテロ接合性の欠如を特定できますが、有意ではない全染色体UPDもピックアップしています。これには慎重な報告が必要であり、私たちはまだ学習曲線を進んでいます。また、親の一人だけが知っている可能性のある血縁関係を特定することも懸念しています。

Q：ラボの次のステップは何ですか？

SAZ：CytoSNP-850Kアレイとの作業の統合に焦点を当て、悪性腫瘍サンプル用の遺伝子パネルのシーケンスにNextSeq 550システムの使用を開始します。将来的には、NGSが自閉症やてんかんに関連する遺伝子変異の検出に役立つことを期待しています。

SNPアレイに移ったとき、大学内のさまざまな研究グループが、細胞株を解析するためにSNPサービスをリクエストしました。以前は、細胞株のアレイ解析を行っていなかったか、高価な民間サービス企業に送っていました。

細胞遺伝学的解析は年間2,000件実施する予定ですが、SNPアレイの使用開始から8か月以内に2,000件以上の症例をすでに実施しています。スループットと効率が向上しました。喜んでいます。