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生物多様性の変化を見ることのできる強力なレンズとなり得るeDNAシーケンス

NGSとeDNAメタバーコーディングにより、研究者はさまざまな生態系を精確にモニタリングできます。

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生物多様性の変化を見ることのできる強力なレンズとなり得るeDNAシーケンス

はじめに

Michael Bunce博士は、オーストラリア、パースにあるカーティン大学の分子生物学者です。博士の研究対象は多種多様ですが、分解したDNAの抽出、増幅、および解析を中心にすべてのプロジェクトが展開しています。博士のTrace and Environmental DNA(TrEnD)ラボでは、古代DNA、生薬、ワイン、野生生物、海水など幅広いサンプルの遺伝子解析研究が行われています。

ここ10年間、Bunce博士は環境DNA(eDNA)の解析において次世代シーケンス(NGS)を使用して生態系の生物多様性を調べています。eDNAとはあらゆる生物が生息する環境中に放出するDNAのことです。博士のチームは、eDNAサンプルの解析と生態系の経時的変化のモニタリングのためにメタバーコーディングと呼ばれるDNAバーコーディングとハイスループットNGSを組み合わせた技術を利用しています。博士のチームによる最近の研究では、海洋サンプル中の生物多様性を判定し、採鉱や石油探索後の自然生態系の復元において機能が回復できているかについて評価しました。

iCommunityは、現在行っているeDNA研究、環境・生物多様性研究におけるその価値、および多種多様な生態系からのサンプルを調べるのにどのようにNextSeq 550システム、MiSeqシステム、およびiSeq 100システムを使用しているかについて、Bunce博士にお話を伺いました。

Michael Bunce博士は、オーストラリア西部パースにあるカーティン大学のSchool of Molecular and Life Sciencesの教授であり、TrEnDラボを率いています。

質問:古生物学や生態学などこれまではフィールドの生物学と見なされてきた領域に分子生物学的手法を使い始めたのはいつですか?

Michael Bunce博士(以下MB):2003年、私は同僚と共に論文を発表しました。この論文では、先史時代のシベリア永久凍土のコア試料やニュージーランドの洞穴堆積物からのDNAの抽出およびシーケンスに成功したことを報告しています1。 これは、何百年も前にその土地に生息していた動物を特定するために化石が必要ではないことを証明した画期的な研究でした。昔の動物たちが残したDNAを検出し、そのデータを用いて植物や動物が長い年月をかけてどのように変化したかを調べることができるのです。

質問:NGSは博士の研究にどのような影響を与えましたか?

MB:2000年代初期に古生物学研究を行っていた頃はDNAの解析が困難でした。サンプルからDNAを抽出し、バクテリアにクローニングし、サンガー法を用いてバクテリアプラスミドをシーケンスしていました。1回に1つずつです。時間とコストのかかる作業だったため、サンプルに含まれる種を徹底的に調べるまでには至りませんでした。

私たちのラボで環境サンプルを簡単に解析し、そこにどのような種が存在していたかを精確に特定できるようになったのは、NGSがあったからに他なりません。バクテリアクローニングとサンガー法では、各サンプルについて確認できるDNAの全体像が限られており、一般に1サンプル当たりに得られるリード数は50~100程度でした。NGSとその大量並列シーケンスにより、私たちはサンプル当たり数万から数十万ものリードを得ることができるようになりました。複数種が含まれる環境サンプルの中で集団を見ることのできる強力なレンズを手に入れたのです。過去10年間は、NGSを用いたメタバーコーディングを多用して多数の異なる生物の生息環境を調べました。TrEnDラボでの研究は、ゲノムをシーケンスすることよりも細菌以外の生物群集における構成や変化を理解することを目的としています。

「さまざまな種間のDNAを比較すると、保存された領域がたくさんあります。しかし、この高度に保存された領域の間には、種を区別し、分類群を決定するためのバーコードとして使用できる高度可変領域が存在するのです。」

質問:eDNAとは何ですか?生物多様性を測定するのにどのように使用できるのですか?

MB:すべての生物は環境中に自身のDNAを放出しています。その遺伝子の「パンくず」により、私たちはある環境に存在する生物や過去に存在していた生物を特定することができるのです。1リットルの海水を有機物成分まで濃縮し、そこからDNAを抽出すると、そのサンプルに含まれる生物多様性が分かります。例えば、分子磁石の役割を果たすPCRアッセイをデザインし、魚のDNAの特定の配列を捕まえてどのような魚がその海水に存在していたのかを調べることができます。種リストを作成することで、さまざまな分類群の有無を確認したり、それを特定の環境における生物相の全体像や分類群間の相互作用を調べるのに使用できます。

eDNAは見つけるのが困難な生物の研究にも役立ちます。例えば、タツノオトシゴは海の中で非常に捕獲が難しい魚の1つです。しかし、私たちは南アフリカとオーストラリアで、海水中のDNAシグネチャーを検出することによりタツノオトシゴを見つけることができました。カモフラージュが非常に上手なため非破壊的方法では調べることが非常に難しいタツノオトシゴやその他の隠蔽種の研究方法に革新をもたらすと思います。

また、eDNAは生態系全体を総合的に調べるのに使用したり、そこに存在する種の健康状態やどのように相互関連しているかのバロメーターとして使用することもできます。逆に、石油流出や外来種の侵入などの重大な汚染が発生した場合、eDNAを使って影響を受けた種を特定し、その経験から学ぶことができます。

質問:eDNAを用いる際に共通する課題は何ですか?

MB:一番の課題は、eDNAを取り扱うということは数当てゲームであるということです。それぞれのサンプルは、わずか数本の針が入った膨大な量の干し草の山のようなものです。1リットルの海水または1グラムの土の場合、一般にそのサンプルに含まれるDNAの99%以上が細菌のものです。特定のターゲットを選択的に濃縮する方法が必要です。海水中のサンゴ種を探しているのに、使用するアッセイが植物プランクトンと交差反応してしまう場合、検出されるのはほとんどが植物プランクトンで、サンゴはわずかまたは皆無になります。そこで、所定のサンプルに含まれる目的のものを効果的にターゲットとし、アッセイ対象ではないものを能動的に除外できる(PCR)アッセイをデザインしなければなりません。

また調べるDNAを濃縮するサンプリング法の最適化も必要です。魚類個体群を調べる場合、海底から得られる堆積物サンプルと海水のどちらに魚のDNAは多く含まれるでしょうか?この情報により、私たちはeDNAが最終的に隠れている生育環境のみをサンプリングする方向に向かうことができるのです。サンゴの研究を終えたばかりですが、この研究では海水にはサンゴDNAが大量に含まれているのに対し、海底の堆積物には非常にわずかな量しか含まれていなかったことが分かりました。

別の課題はDNAの入手です。効率的なDNA抽出法を使用する必要があります。最適ではない方法を使用すると、存在量は少ないものの存在している種を検出できない可能性があります。

質問:環境サンプルに含まれる生物多様性を調べるにはどのNGS法を使用していますか?

MB:私たちはショットガンシーケンスとeDNAメタバーコーディングという2つのNGS法を使用しています。

ショットガンシーケンスは、数の利がある場合には素晴らしい方法です。例えば、細菌または植物プランクトンのような小さな真核細胞を検出する場合です。ただし、海水サンプルでは役に立たないことが多いです。干し草の山が大きすぎるのです。

ほとんどの環境サンプルにはeDNAメタバーコーディングを使用します。スーパーに並んでいる製品のように、すべての生物には関連づけられた独自のバーコードがあります。この場合、DNAバーコードです。さまざまな種間のDNAを比較すると、保存された領域がたくさんあります。しかし、高度保存領域間には、種を区別し、分類群を決定するためのバーコードとして使用できる高度可変領域があるのです。

種を区別したい場合には、メタバーコーディングとターゲットアッセイを使用します。このeDNAメタバーコーディング法はこれまでに氷床コア、沼地からの泥、遺跡発掘現場、海水、糞便サンプル、生薬で使用しました。eDNAメタバーコーディングは多数のアプリケーションで応用できます。

「デザインし、導入するアッセイには独創性が必要であり、これらのアッセイは調べようとしている植物や動物に応じてカスタマイズしなければなりません。」

質問:Tree of Life(ToL)メタバーコーディングとは何ですか?またこの方法をどのように海洋生態系研究に使用しましたか?

MB:ToLメタバーコーディング法の考え方は、1つの環境サンプルの完全な多様性を1つのアッセイで調べることはできない、ということです。最近の研究で、9リットルの水サンプル1つを入手し、ショットガンシーケンス、細菌メタゲノム解析、細菌16Sシーケンス、および10の異なる分子アッセイで解析しました2。これらのアッセイでは、サンゴを検出したアッセイもあれば、魚類を検出したアッセイもありました。さまざまなアッセイの長所と短所を理解し、ショットガンシーケンスをNGSメタバーコーディングと比べるために、1つのサンプルから可能な限りあらゆることを調べました。

すぐに分かったことは、少なくとも海水に関しては、生態系全体における幅広い多様性を1つのアッセイで調べることはできないということでした。デザインし、導入するアッセイには独創性が必要であり、これらのアッセイは調べようとしている植物や動物に応じてカスタマイズしなければなりません。

質問:生態系の復元を調べるにはeDNAメタバーコーディングをどのように使用できますか?

MB:オーストラリアには、現在自然生態系の機能を取り戻させようとしている採鉱場が多数あります。通常、その地域に昔生えていた自生樹木を植えて数年待ちます。その間は、復元が正しい軌道に乗って進んでいるか分かりません。

私たちは、eDNAメタバーコーディングでそこに昔何が存在していたか、何を植えるべきかを調べることができると考えています。その生態系に自生する昆虫、受粉媒介者、そして細菌が戻ってきているかどうかを測定することができました3。 eDNAメタバーコーディングを使って、動物の糞、空気、水サンプルを解析することでどのような動物や昆虫が存在しているかを調べることができたのです。得られたデータから、その環境に生息するさまざまな動物、植物、および昆虫の生物学的秩序を明らかにして、復元の取り組みが効果的であるかどうかを確認することができました。

このような研究の主な課題の1つが正しく実験をデザインすることです。例えば、糞サンプルを採取する場合、サンプルを1つずつ解析することはしません。すべての糞サンプルを1つの大きなミキサーに入れてすべて混合し、DNAを抽出します。このプロセスは時間面でもコスト面でも効率的です。

「イルミナのNGSシステムでは非常に高いシーケンスフィデリティが得られます。これはメタバーコーディングで環境サンプルを解析する際に非常に重要なことです。」

質問:eDNAで調べられることには限界がありますか?

MB:サンプルから直接抽出するeDNAが存在する生物の数と直接的に相関しているのか、ひいては存在量の測定に使用できるのかどうかについての疑問はあります。生物が残すDNAはさまざまであるため、厳密に相関することはないでしょう。しかしながら、異なる領域で種の存在の有無を調べることはできます。十分な数のサンプルを再現すれば、存在の有無のデータを相対存在量の測定に変えることができます。現在、eDNAデータセットから可能な限り多くのことを推定することに焦点を合わせた研究が多数進行中です。

eDNA解析のもうひとつの限界としては、DNAバーコードを忠実に種に割り当てることができるかどうかはデータベースの安定性に左右されるということが挙げられます。世界中の研究者がこのデータベースを現在構築中です。

質問:eDNA法の導入に興味のある他の研究者たちへ何かアドバイスはありますか?

MB: eDNA法は、アプローチとしては非常に単純に見えるかもしれません。現実には、うまく実施するのは難しいです。時間の経過に伴い、サンプルの汚染が現実的な問題となります。生成されるデータの忠実度を維持するためには清潔なラボ環境でDNAの採取、保管、および抽出をどのように行うべきかを下調べすることをおすすめします。例えば、私たちは研究の早い段階で、eDNAライブラリー調製に使用した2ステップPCR法は多数のアーチファクトを発生させ、汚染に非常に影響を受けやすいことを確認しました。

質問:現在の研究ではどのNGSシステムを使用していますか?

MB:イルミナのNGSシステムでは非常に高いシーケンスフィデリティが得られます。これはメタバーコーディングで環境サンプルを解析する際に非常に重要なことです。私たちは使用しているDNAバーコードがきちんとコピーされていることに確信を持てなければなりません。私たちのラボでは、ショットガンシーケンスを用いるすべての研究(サンゴと魚類のミトコンドリアゲノム)でNextSeq 550システムを使用しています。MiSeqシステムは、メタバーコーディングワークフローのアンプリコンシーケンスで使用しており、ラン当たりのコストが非常に手頃です。MiSeqシステムは私たちのToLメタバーコーディング研究に最適でした。600塩基対までの長いDNAセグメントを増幅できたからです。

つい先日、iSeq 100システムを受け取りました。MiSeqシステムとほぼ同じ機能ですが、さらに小さく、移動させやすいです。ラボ環境外でDNAシーケンスをどのように実施できるかをシミュレーションするためにiSeq 100システムを使っています。iSeq 100システムのおかげで、私たちは他のプラットフォームでは現在到達していないシーケンスフィデリティを維持しながらデータを迅速に変換できるようになるでしょう。

質問:eDNAデータをどのように解析しますか?

MB:メタバーコーディングワークフローでDNAを増幅する場合、ナンバープレートのようなインデックスをDNAバーコードの前後に付けます。こうすることですべてのDNAリードを特定のサンプルに割り当てることができます。解析する前にエラーやアーチファクトと考えられるものを除きます。USEARCHやDADA2などのバイオインフォマティクスツールは、このアーチファクトを特定し、データセットから取り除くのに役に立ちます。バックグラウンドノイズを抑えるため、データは積極的にフィルタリングします。クリーンなデータセットが得られたら、BLASTなどのアライメントアルゴリズムを用いて全てのバーコードをリファレンスデータベースに対してクエリを実行します。GenBankや私たちが構築したカスタムデータベースを使用することもあります。

分野としては、eDNAはデータ解析法に関してまだ独り立ちしていません。データを高速処理する方法はたくさんあります。肝心なのは、希少な分類群を検出するのに必要な感度を維持しながらバックグラウンドアーチファクトから真のパターンを見分けることです。

「データを高速処理する方法はたくさんあります。肝心なのは、希少な分類群を検出できる感度を維持しながらバックグラウンドアーチファクトから真のパターンを見分けることです。」

質問:NGSで可能になったeDNAアプリケーションには他に何かありますか?

MB:eDNAの潜在的なアプリケーションは挙げればきりがないです。現在、eDNAのアプリケーションとして考えられるのは港湾モニタリング、ベースライン生物多様性調査、バラスト水検査、土壌検査、糞(食性)分析、発酵動態、および食品/医薬品原料などがあります。このリストは増え続けています。

質問:教授はeDNA Frontiersというベンチャー企業を立ち上げているところですね。顧客のサポートに教授のeDNAメタバーコーディング法をどのように使用するのですか?

MB:現在、民間のeDNAサービスラボがいくつか立ち上げられています。私たちのeDNA Frontiersのサービス提供は2019年に開始する予定で、ここ10年間に開発したワークフローの一部を使った店頭モデルになる予定です4。 私たちの顧客は海洋や陸地システムにおける計画承認の取得を目指す資源関連の企業や団体などになるでしょう。

eDNAデータは特定の場所における経時的な生物学的変化をモニタリングするための「保険」として使用できると考えています。例えば、作業開始前に現場の生態系がどのようなものなのかを知りたい顧客がいます。eDNAは、その生態系の生物相に生じる良い変化と悪い変化を確認するためのツールとして使用できるでしょう。作業が環境に対して有害な影響を及ぼす場合、それを早く知ることで影響を軽減させることができます。

また、企業が私たちにサンプルを提出して私たちがそれを長期にわたり保持するためのeDNAバイオバンクも設立中です5。これらのサンプルはベースラインとなり、それより後に得られたサンプルとデータを比較して環境がどのように変化しているかを確認することができます。

「eDNAを用いるバイオモニタリングは、環境保全を担う世界中の環境保護機関にとって欠かせないツールとなるでしょう。」

質問:今後eDNAはどのように使用され、研究されていくと思いますか?

MB:ひいき目かもしれませんが、eDNAは最も強力なバイオモニタリングツールの1つへと進化し、その分野の成長に伴いさらに一層有益になるでしょう。eDNAを用いるバイオモニタリングは、環境保全を担う世界中の環境保護機関にとって欠かせないツールとなるでしょう。これらの機関は、特定の地域で採掘や石油掘削装置の設置を求める企業に対して検査を実施できるようになります。これらの企業は、現場の開発前に環境DNAサンプルを採取し、その後も6~12カ月ごとにバイオバンクへサンプルを提出するよう義務付けられるかもしれません。石油流出や外来種の突然の出現などの重大なインシデントが発生した場合、環境保護機関はこれらのeDNAサンプルを使用して企業が環境に与えた影響を測定し、関係者に責任を課すことができます。データを見れば明らかなのです。

質問:他にはどのような研究をされていますか?

MB:私たちのラボは、教育および地域の環境との関わりに情熱を注いでいます。今、Sequence Our Seas(SoS)というeDNAに関する地域サイエンスプロジェクトを立ち上げようとしているところです。学校を訪問して、生徒たちにサンプルボトルを渡します。生徒たちは近くのビーチや水路に行き、1リットルの海水を汲み、教室でその水をろ過します。そして私たちのeDNAワークフローを使ってフィルターに残った内容物を分析し、存在するすべての魚、鳥、哺乳類のリストを作成します。

このプロジェクトは、人びとが自分たちの住む場所の海洋生態系においてさまざまな人為的ストレスを受けている生態と関わることのできるパイプとなります。また、私たちが非常に重要であると感じている遺伝的リテラシーを人びとに教えることもできます。

このインタビューに登場するシステムについての詳細は、以下のリンクからご覧いただけます:

NextSeq 550システム

MiSeqシステム

iSeq 100システム

参考文献
  1. Willerslev E, Hansen AJ, Binladen J, et al.Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments.Science.2003; 300: 791-795.
  2. Stat M, Huggett MJ, Bernasconi R, et al.Ecosystem biomonitoring with eDNA: metabarcoding across the tree of life in a tropical marine environment.Sci Rep.2017; 7(1):12240. doi: 10.1038/s41598-017-12501-5.
  3. Fernandes, van der Heyde M, Bunce M, et al.DNA metabarcoding—a new approach to fauna monitoring in mine site restoration.Restor Ecol.2018; doi.org/10.1111/rec.12868
  4. eDNA frontiers, Environmental DNA, Biomonitoring Solutions.www.ednafrontiers.com/.Accessed January 9, 2019.
  5. Jarman SN, Berry O, Bunce M. The value of environmental DNA biobanking for long-term biomonitoring.Nat Ecol Evol.2018; 2:1192-1193.