インタビュー：NGSを使用した希少な未診断の遺伝性疾患の研究

はじめに

希少疾患は少数の個人グループのみに影響します。しかし、小さなという用語は相対的なものです。米国では、National Center for Advancing Translational Sciencesによると、希少疾患は20万人以下と定義されています。¹ 欧州では、2000人に1人未満の場合、希少疾患と見なされます。² 韓国では、韓国の未診断疾患プログラム（KUDP）は、2万人未満の場合、または希少性のために有病率が不明な場合、希少疾患であると判断しました。³ これらの小さなグループはすべて合計されます。7,000もの希少疾患が知られており、その多くはまだ発見されていないため、世界中の何千万人もの人々が影響を受けています。残念なことに、これらの患者の多くは、信頼性と精度の高い臨床ツールがないため、未診断のまま未治療になる可能性があります。Murim Choi博士は、これらの患者の将来を変えるために取り組んでいます。

ソウル国立大学（SNU）医学部の准教授であるChoi博士は、小児神経発達障害を研究するために地元の臨床医と緊密に連携しています。SNU College of Medicine Functional Genomics Labの主任研究者として、またKUDPの数多くの研究活動に貢献しているChoi博士の目標は、次世代シーケンサー（NGS）やその他の形態の遺伝子解析を使用して、さまざまなヒト疾患の分子メカニズムを理解することです。彼は、全エクソームシーケンス（WES）を使用して、さまざまな希少疾患疾患で原因となる役割を果たす可能性のある遺伝子変異を特定するパイオニアです。キャリアの初期に、彼はPerlプログラミング言語を自ら教え、彼の研究で得られたデータを理解する能力を高めました。最終的に、Choi博士の目標は、パズル症状を呈することが多い希少疾患の患者の診断に貢献することです。

iCommunityは、Perlプログラミングへの愛情、過去10年間のWESの使用、希少疾患研究におけるNGSの今後の使用方法について、Choi博士と話しました。

Murim Choi博士は、SNUの准教授であり、SNU College of Medicine Functional Genomics Labの主任研究員であり、KUDP研究に貢献しています。

Q：遺伝学研究のキャリアに興味を抱いたきっかけは何でしたか？

Murim Choi（MC）：私はもともと、発生生物学者としてのトレーニングを受け、分子生物学の学士号を取得していました。常に心臓の発達について学びたかったので、デューク大学でマウスシステムで心臓がどのように発達したかを研究しました。ゲノミクスではなく、胚やマウスの遺伝学です。2000年初頭、私は特定のマウス系統で心臓の問題を引き起こした遺伝的バリアントによる表現型のバリエーションを研究していました。これは、遺伝学と遺伝子型と表現型の関係の世界に私を導いたプロジェクトでした。ヒトの遺伝学を研究したいと思いました。

Q：ヒト疾患の遺伝学の研究を開始したのはいつですか？

MC：2007年、イェール大学のリチャード・リフトン博士の研究室で働き始めました。イルミナSNPアレイを使用して、疾患ゲノムの遺伝子型、ヘテロ接合性、コピー数変動（CNV）を調べました。また、ゲノムワイド関連解析（GWAS）も実施していました。私にとってはまったく新しい世界でした。

"今日、NGSのコストは劇的に低下しており、希少な遺伝性疾患の評価における最初のステップの1つとして、定期的にWESを実施しています。"

Q：Perlコーディング言語を教えるきっかけとなったのは何ですか？

MC：私は、リフトン博士の研究室で作成したデータを管理できるように、コーディングを研究する必要があると判断しました。1歳の息子と一緒に書店に行き、当時バイオインフォマティクスのメインツールであったPerlで本を手にしました。日中、私はDNAを調製し、GWASを実施するラボにいました。夜、息子を寝かせた後、私はPerlについて学びました。とても楽しかったです。

GWASデータ解析のための公開ツールがなかったため、Perlに関する知識を用いてゲノム変化と下流解析をデザインしました。私は、私が取り組んでいたコホートのGWASデータをDr. Liftonに見せ、解析が気に入っていました。彼は、ラボベンチに戻るべきではないと言い、私が同意した遺伝子データを解析し管理するスキルがあることを勧めました。データを消化し、理解できると非常にパワフルだと感じました。

Q：リフトン博士の研究室は、心血管疾患の研究で知られていました。希少疾患や未診断の遺伝性疾患の研究にどのように関与しましたか？

MC：リフトン博士の研究室での私の仕事は、個人のゲノムを非常に広い範囲で調べることを可能にしました。彼は、解析のために持っていたすべてのデータセットを私に提供してくれました。2009年に最初のNGSシステムが導入されたとき、Dr. LiftonはラボでWESパイプラインをセットアップするよう私に依頼しました。最初のプロジェクトの1つは、希少疾患と診断された患者のエクソームシーケンスにNGSを使用することでした。

Q：これらの希少疾患の一部はなぜ診断が難しいのでしょうか？

MC：希少疾患は、主にメンデル性疾患と単一遺伝子疾患です。症状は多様で複雑であり、発症初期に発症します。これらの機能により、臨床医は診断が困難になります。したがって、患者の居住地や臨床医の経験は、希少疾患の診断において重要な役割を果たします。簡単で明快な希少疾患であれば、患者は自宅に近いクリニックですぐに診断されます。しかし、すべての医師が希少疾患の診断に十分な経験を持っているわけではないため、患者を誤診する可能性が高くなります。韓国では、現地の小児科医が、SNU小児病院の臨床医にこれらの患者を紹介する場合があります。私は病院に所属しています。病院は私のラボの向かい側にあります。私の研究室は、これらの疾患を研究するのに最適な場所にあります。

"...私たちのグループは、CRISPRやシングルセルベースのNGS解析など、より機能的なゲノム技術を実施しています。"

Q：希少疾患を有する小児患者に対して、遺伝子評価はどのようなことを提供できるか？

MC：遺伝子評価を行っても、希少疾患患者に対して利用できる治療法が必ずしもあるわけではありません。デノボ変異の場合、その後の子供がこの疾患に罹患する可能性は低いことを親に伝えることができます。疾患が劣性バリアントの結果である場合、両親には、2人目の子供をもうける前に変異の事前スクリーニングを受けるよう助言することができます。

時には、子供や家族に直接支援を提供できます。1つのシナリオは、同定された変異が代謝経路の酵素にあり、重要な代謝産物が欠如している場合です。このような場合、これらの代謝産物を補充して症状を改善することができます。

もう1つのシナリオは、希少疾患ではない変異をターゲットとする現在利用可能な薬剤があるバリアントを特定することです。例えば、数年前に、自己免疫反応と炎症過剰反応に重要な遺伝子にde novo変異を持つ患者を同定した事例が2件ありました。1人の患者の重度の自己免疫システムは、欠陥遺伝子機能を強化するための抗体を機能的に模倣することで緩和されました。⁴ 他の患者の血管症は、遺伝子機能の増加を減らすためのシグナル伝達阻害剤によって緩和されました。⁵

しかし、解析対象の患者のほとんどは小児神経科の患者であり、その症例は複雑です。神経疾患は、根底にある遺伝学の理解におけるブレークスルーが最も必要とされる場所です。

Q：希少疾患に関連するバリアントを同定する上で、NGS技術は古い遺伝子技術と比べてどのような利点がありますか？

MC：初めてLiftonラボに入所したとき、私は若い遺伝学者であり、NGSが何を提供できるかについて知らされていませんでした。シーケンスの堅牢性が高まっていることについて、人々が話しているのを聞きましたが、それが何を意味するのかわかりませんでした。私が知っていた唯一のシーケンスはサンガーシーケンスで、それをより速くする利点は理解できませんでした。

すぐに、NGSがどれだけ高速でゲノムのカバレッジが最適であったかに気づきました。しかし、SNUでは、最初に臨床医と協力した際、NGSのコストが原因ですぐにNGSを使用しないよう注意していました。まずはサンガー法または臨床的解釈に基づく焦点を絞ったスクリーニングアプローチから始めます。答えが得られなかった場合は、未知の遺伝子をより多くカバーし、予期しない遺伝子の変異を同定し、新規症候群や未認識の疾患を説明することができるため、WESに移行します。

今日、NGSのコストは劇的に低下しており、希少な遺伝性疾患の評価における最初のステップの1つとして定期的にWESを実施しています。すべての希少疾患患者の遺伝学をより良く理解するために、NGSを使用してすべての希少疾患患者のシーケンスをやり直すことは、もはやコストがかかりません。これにより、これまで認識されていなかった遺伝子型で患者を層別化することができます。希少疾患の研究ではNGSの使用が増加すると思います。

"イルミナのシーケンスデータは、過去10年間で改善されてきました。品質管理パイプラインはありますが、データが非常に安定しているため、危険信号が発生することはめったにありません。"

Q：NGSはどのようにして独自の研究を可能にしますか？

MC：当研究室では、全ゲノムシーケンス（WGS）やWESなどの患者ゲノムシーケンスと機能ゲノムの2種類のNGS研究を行っています。どちらのアプローチもNGS技術をうまく活用しています。機能的ゲノミクス研究では、細胞機能に対する意義不明のバリアントの影響を評価します。希少疾患の患者を経時的に追跡する際に、この情報を使用することができます。非常に包括的な読み方が得られます。

Q：研究でWESを使い始めたきっかけは何ですか？

MC：リフトン博士の研究室でWESを使用して、6つの被験者サンプルを解析しました。いずれも既知の変異がなく、血縁関係にある婚姻から妊娠した患者から5名でした。当時、これらの個人ではホモ接合型バリアントの検出がはるかに容易でした。5名中1名がバーター症候群と診断されました。バーター症候群に関連する変異は見つかりませんでしたが、塩化物チャネル遺伝子の変異は同定されました。この研究結果は、腎臓病におけるバーター症候群の生物学に関する洞察を持つポスドクと話し合いました。患者の症状の原因は、バーター症候群ではなく、先天性の塩化物下痢に関連する塩化物チャネルの破壊にあると示唆しました。幸いにも、先天性の塩化物による下痢を治療する薬があり、被験者の症状の一部が軽減されました。これは、希少疾患患者の診断にNGS技術がどのように役立つかを示した最初の研究でした。⁶

Q：研究におけるWESの利用はどのように進化しましたか？

MC：WESが希少疾患の診断に役立つ可能性があると報告されてから10年が経過しました。WESを使用して、SPONASTRIME異形成におけるTONSL変異、GM1ガングリオシドーシスにおける⁷つのGLBI変異、レット症候群における⁸つのGABBR2変異を同定しました。⁹ WESの価値はもはや秘密ではなく、現在では応用産業や診療所で日常的に使用されています。私たちが協力する小児臨床検査室では、現在、定期的にWESを実施しています。面白いことに気付いたら、より深く研究するために私たちに届けてくれます。

WESは非常に安定した手法です。しかし、基本的な科学者として、WESは臨床検査室でカバーされるべきだと考えています。そのため、CRISPR（クラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）ベースのスクリーニング手法やシングルセルベースのNGS解析など、より機能的なゲノム技術を実施しています。私たちの手法は変わったかもしれませんが、私たちの目標は変わっていません。表現型と遺伝子型の関係性については、今でも関心があります。我々は、希少疾患の存在を特定するために、患者の表現型データを理解するために機能的ゲノミクスデータを使用しています。

"希少疾患患者のサンプルでWESを実施する臨床検査室が増えると思います。クリニックにはWGS用の場所もあります。"

Q：SNU School of Medicine Functional Genomics Labの焦点は何ですか？

MC：私たちのラボは、超希少疾患の遺伝学に焦点を当てています。コホートのプールがあり、新しい遺伝子型と表現型の相関関係について興味深い発見をしました。当社は、この情報を使用して、世界中の臨床医や研究者と遺伝子や表現型情報を共有するプラットフォームであるGeneMatcherを使用したコラボレーションを確立しています。これは、細胞で実際に起こっていることの生物学への窓を与えてくれます。これにより、同定した新規遺伝子が潜在的な治療標的となりうるかどうかを知ることができます。

また、データ解析研究も実施しています。約700人の発端者とその両親のデータを集めました。英国および主要なコンソーシアムで現在進行中の大規模データプロジェクトと比較すると小規模の研究ですが、データベースを構築する際にデータをコントロールや比較に使用することができます。

先ほど申し上げたように、韓国には血縁関係にある既婚や多くのホモ接合性変異はありません。しかし、複合ヘテロ接合バリアントの患者は高い頻度で発生しています。データベース内の発端者ファミリーの数を増やすことができれば、希少疾患や関連する変異の親候補の事前スクリーニングに使用するための遺伝子パネルを作成するために必要な情報が得られると考えています。NGSのコストが下がるにつれ、検査のコストはより手頃になり、子供を持つことを考えているカップルが利用できるようになります。

Q：どのようなNGSシーケンスシステムを使用していますか？

MC：リフトン博士の研究室でWESパイプラインをセットアップする際に、HiSeq 2000システムを使用しました。Functional Genomics Labでは、HiSeqおよびNovaSeq 6000システムを使用するサービスラボにシーケンスを委託しています。イルミナのシーケンスデータは、過去10年間でさらに良くなりました。品質管理パイプラインはありますが、データが非常に安定しているため、危険信号が発生することはめったにありません。

Q：研究チームはKUDPにどのように貢献していますか？

MC：Jong-Hee Chae博士は、小児臨床医であり、KUDPの治験責任医師であり、私の最も近い協力者の一人です。KUDP小児神経学プログラムを運営し、5,000の神経発達コホートのデータベースを作成しました。最近、WESパイプラインを彼女のラボに移植することに成功しました。私は、発見された異なるバリアントの遺伝子解釈に関与しており、臨床医会議に参加して解析をレビューしています。

Q：希少疾患や未診断の遺伝性疾患の研究において、NGSの将来についてどう思いますか？

MC：NGS法の使用は今後も増え続けると思います。臨床ラボが実行する手法と、基礎科学ラボで使用される手法には、さらに違いがあります。

希少疾患患者のサンプルでWESを実施する臨床検査室が増えると思います。クリニックにはWGS用の場所もあります。WGSを用いてリンク解析研究を行い、研究対象領域を絞り込むことができます。組織サンプルのRNA-Seqを使用して、目的の遺伝子をピンダウンすることもできます。最終的には、WGSは韓国の臨床検査室で日常的に使用されると思います。

希少疾患を研究する基礎科学ラボでは、ゲノムで探しているものについて確固たる仮説があれば、RNA-Seqを引き続き実施します。また、CRISPRやその他の合成プライマーを使用して、より機能的なゲノミクススクリーニング実験も実施し、最終的には、発見と患者の表現型情報を比較できるようにします。