マイクロバイオーム研究の時代の到来

はじめに

Joseph Petrosino博士は、1993年にBaylor College of Medicineに入学してから1回だけでなく3回も、適切なタイミングで適切な場所にいることに気づきました。微生物叢研究の開始とその後の学界から商業アリーナへの拡大に不可欠な要素になるための一歩を踏み出すたびに。

まず、BaylorのHuman Genome Sequencing Centerで、Common Fund Human Microbiome Project（HMP）が発表されました。米国国立ヒトゲノム研究所（NHGRI）のイニシアチブであったため、ゲノムセンターはジャンプスタートフェーズの先頭に立っていました。Human Genome Sequencing CenterのディレクターであるRichard Gibbsは、Petrosino博士にBaylorでのイニシアチブ構築の支援を依頼しました。Petrosino博士は、細菌ゲノミクスの経歴から、次世代ゲノミクスプラットフォームを活用して、あらゆる種類のサンプルから微生物を培養することなく、国勢調査と機能的能力を提供することに非常に興味を持っていました。

2010年にHMPの取り組みが縮小した時、Petrosino博士はトランスレーショナル微生物叢研究センターを建設するというアイデアで大学にアプローチしました。目標は、ゲノミクスと発見に基づくパイプラインを、宿主と微生物の関係の解消へと移行することでした。特に微生物コミュニティの機能については疾患に結び付けました。1年後、ペトロシノ博士をディレクターとして、Center for Metagenomics and Microbiome Research（CMMR）が設立されました。

間もなく、CMMRは製薬会社からマイクロバイオームプロジェクトを支援するよう依頼を受けました。商業プロジェクトに必要な厳しい納期に対応するため、Baylorは2015年にDiversigenというマイクロバイオームサービス会社を設立しました。Petrosino博士は同社の最高科学責任者であり、彼の時間の約10%をDiversigenプロジェクトのリソースとして費やし、残りの90%はCMMRを率いていました。

Petrosino博士によると、CMMRはDiversigenの活動から利益を得ています。Diversigenは営利企業として、CMMRチームがその知識を、新しい治療法や診断法の開発の最前線にいる人々に関連付けることを可能にします。その結果、CMMRの学術的発見から有益な市販製品への転換が加速しました。最近、DiversigenはOrasure Technologiesに買収され、微生物叢解析におけるエンドツーエンドのサービスがまとめられました。

iCommunityはPetrosino博士と、微生物研究の価値、研究デザイン戦略とNGSの使用が過去10年間でどのように進化してきたか、そして将来の展望について話しました。

Joseph Petrosino博士は、CMMRのディレクターであり、Diversigenの最高科学責任者です。

Q：Human Microbiome Projectの当初のビジョンはどのようなものでしたか？

Joseph Petrosino（JP）： 共生生物を研究し、微生物研究のための次世代シーケンサー（NGS）技術の導入を開始した研究者が世界中に多数いました。NIHは、この微生物叢が多くの疾患領域に影響を与える可能性があり、多くのNIH研究施設に影響を与える可能性があることを認識していました。また、マイクロバイオーム研究にどのツールがどの目的で最適かに関する方法論、戦略、ベストプラクティスを開発する必要があることも認識しました。HMPの取り組みは、データの収集、ベストプラクティスと手法の理解、研究者が独自の研究プログラムを構築するために使用できるリファレンスデータセットとプロトコルの開発という点で、ヒトゲノムプロジェクトと密接に類似していました。

Q：HMPプロトコールのセットアップで何を学びましたか？

JP：当社のHMPの取り組みは、ベイラー医科大学とセントルイスにある2つの中核臨床センターのワシントン大学から300名の被験者からなるコホートを構築することに重点を置いていました。臨床面では、募集プロトコールの開発に多くの時間が費やされました。300名の被験者は、12ヵ月間に最大3回、最大18の身体部位から採取されます。

方法論の観点から、収集した多くの異なるサンプルタイプに対応できる最適な抽出方法を特定しました。これらのプロトコールのベンチマークと検証の方法を理解することは、当初考えられていたよりも精緻で厳格な取り組みでした。これらの300名の被験者から最初に得られた所見は、生物の多様性が人によって異なっても、各身体部位の機能的な構成要素が保全されたことです。

Q：Diversigenが設立された理由

JP: メタゲノミクス・微生物研究センターは、医療センター環境でトランスレーショナルな学術研究を行うために設立されました。しかし、いくつかのファーマコマーシャルチームがマイクロバイオームプロジェクトに来てくれました。彼らは学術研究を支援していましたが、例えば、1年生の大学院生が彼らのためにプロジェクトに取り組んでいることに抵抗を感じていました。彼らは、データセットのトラブルシューティングと解析を行う熟練した個人とともに、より厳しいスケジュールでプロジェクトを完了させたいと考えていました。Diversigenは、微生物叢研究の営利組織のニーズに応えるために2015年に設立されました。

私がセンターを立ち上げたとき、私は、製薬企業がマイクロバイオームをどう見ているかを知るために、マイクロバイオームサービス会社を設立する可能性を指摘していました。アカデミックとして、私たちは自分の分野、そして公衆衛生に最も貢献するためにその分野を成長させるべき分野を最も良く理解していると考えています。しかし、製薬業界は、その見識とは大きく異なる視点を持っている可能性があります。Diversigenはその空間にレンズを与え、微生物叢に対する考え方を変えました。それは、すぐに使える、収益性の高いオペレーションでした。

NovaSeq 6000システム上でマルチプレックスを行う能力は、非常に役に立ちました。今後もNovaSeqを他のアプリケーションにも使用していきます。

Q：Diversigenのユニークな点は何ですか？

JP：Diversigenは、特に製薬企業やバイオテクノロジー企業などの商業顧客に対するRolls Royceマイクロバイオームサービスプロバイダーであることを誇りにしています。学術研究室は、ほぼDiversigen研究開発部門の一部であると考えられ、最先端の最前線のアプリケーションと成熟した戦略を提供し、当社が学術的に製造するデータに匹敵するデータを提供することができます。それ以来、Diversigenは広範な内部解析チームを構築し、商業研究に最適な独自のベストプラクティスを開発しました。

Diversigenチームは、コンセプト段階から結果に至るまで、そしてその先まで、お客様と関わります。研究デザインに協力し、サンプルの採取、保管、発送方法についてアドバイスし、どのシーケンス手法が彼らのニーズに最も適しているかを推奨します。

マイクロバイオーム企業には大きな成長が見られ、その多くは学界のマイクロバイオーム専門家によって設立されました。これらの企業の多くは、特に製薬業界では、微生物分析の専門家が不在です。世界中の200人以上の協力者とともに、400を超える学術プロジェクトに取り組んできました。さまざまな疾患や、その中で微生物叢が果たす潜在的な役割について、重要な洞察を得ています。これらの企業は、次のステップや潜在的な下流アプリケーションについて、Diversigenチームにフィードバックを与え、助言を与え、相談を頼りにしています。

Q：Diversigenプロジェクトの平均サンプル数はいくつですか？

JP: 5-20サンプルで研究をしていた。現在、当社のプロジェクトのほとんどには数百のサンプルがあり、数千のサンプルもあります。縦断的にサンプリングされた大規模コホートのプロジェクトを管理する方法に関するベストプラクティスを確立しました。これには、データ内の交絡ノイズを減らしながら、効率を最大化するためにこれらのサンプルを収集、保管、およびバッチ処理する方法が含まれます。

Q：製薬業界の顧客との臨床試験に取り組んでいますか？

JP：製薬会社との提携を初めて開始したとき、当社は臨床検査室改善修正（CLIA）および米国病理医協会（CAP）認定パイプラインの開発を開始しました。製薬会社のお客様には、当社が作成したデータが高品質で、再現性があり、検証済みで、規制当局への提出に理想的なものであるという安心感を持っていただきたいと考えていました。

製薬会社のパートナー数社が臨床試験段階に入っており、これらの試験の一部ではシーケンスと解析を実施しています。多くの場合、これらは数年にわたるプロジェクトであり、得られたデータから可能な限り多くの情報を抽出できるように、追加のベストプラクティスが採用されています。

Q：通常どのようなサンプルタイプとサイズを受け取りますか？

JP: 微生物叢の好むサンプルタイプはまだ便です。安定化試薬の登場により、サンプルの安定性を維持するために氷上でサンプルを出荷する必要がなくなり、より簡単になりました。

もちろん、当社では、準理想的な低バイオマスサンプルを受け取る多くのプロジェクトがあります。HMPプロトコールの構築における専門知識により、このような困難なサンプルタイプのプロトコールを開発し検証する確立されたチームがあります。私たちの目標は、どんなに小さなサンプルであっても、どのような種類のサンプルでも意味のあるデータを得ることです。

納期は数週間ではなく数日です。イルミナのNGSシステムでは、シーケンサーが常に稼働するように、プロジェクトを事前にスケジュールすることができます。

Q：Diversigenプロジェクトではどのようなシーケンスを使用していますか？

JP：解析対象のコミュニティに応じて、16S遺伝子内の複数の可変領域で16Sシーケンスを実行します。特定の可変領域は、口腔、皮膚、便など、特定のタイプのコミュニティに対してより良い解像度を提供します。

真菌や真核生物のコミュニティでは内部転写スペーサー2（ITS2）シーケンス、マイクロ真核生物では18Sシーケンスを実施しています。メタゲノム解析、微生物コミュニティ株、種レベルおよび機能レベルの決定には全ゲノムショットガンシーケンスを使用します。また、ロングリードシーケンスも行います。質問とアプリケーションに応じて、ロングリードシーケンスとショートリードシーケンスを一緒に使用して、旧式と同様にシングルストレインシーケンスのシーケンス品質を向上させることがありますが、現在ではより高速で安価になっています。

トランスクリプトミクスやメタトランスクリプトミクスのパイプラインがあり、手法や分析の観点から改良し続けています。ウイルスメタゲノミクスも私たちの活動の重要な一部です。当社は、臨床的な観点からウイルスメタゲノムサンプルを解析する能力を向上させるために、かなりの時間を費やしてきました。これらのサンプルの一部は、非常に小さく、ウイルスをスピンダウンして沈降勾配で精製します。これは従来のウイルス学ラボでは不可能であったため、拡張不可能です。弊社は、サンプルの取り扱いという点で、分析を使用してこれらの困難なサンプルからできるだけ多くのウイルス情報を引き出すという、より少ないアプローチを採用しています。

Q：過去5年間で、研究デザイン戦略とNGSの使用はどのように進化しましたか？

JP: 初期のマイクロバイオーム研究では、例えばHMP中に、特定のコホートに対して縦断的ではなく横断的な解析を実施するために、他の目的で収集したサンプルを活用することがよくありました。 微生物叢解析のためにサンプルが適切に収集または保管されていない可能性があり、それ以来学習してきたように、単一のタイムポイント解析では、特定の微生物コミュニティで発生している現象の全体像が常に得られるわけではありません。今では、特定の疾患について症例と対照が十分に一致し、前臨床モデルを使用して、健康や疾患と微生物の関連性の根底にある機能メカニズムを解明するプロジェクトが増えています。

また、企業が16Sシーケンスの限界に気づき、微生物叢ベースの研究の予算を増やしたため、全ゲノムショットガンシーケンスに移行し、機能的な遺伝子パスウェイと系統ベースの情報を取得して、存在する微生物叢をよりよく研究するようになりました。同様に、トランスクリプトミクスも増加しており、サンプルが採取された特定の時間にどの遺伝子がオンになっているかを評価することができます。

典型的なマイクロバイオームプロジェクトのサイズを考えると、NovaSeq 6000システムの容量は、当社が長期間ビジネスを続けることができるでしょう。

Q：メタゲノムデータやトランスクリプトームデータから疾患について何を知ることができますか？

JP：メタゲノミクスとメタトランスクリプトミクスにより、健康な人に存在するか、特定の疾患に関連する微生物や機能、およびそれらが疾患にどのように関連するかを決定できます。縦断的サンプルでは、データは疾患の発症または増悪に関連する可能性があります。特にトランスクリプトミクスでは、遺伝子発現が特定の疾患や増悪状態と関連しているかどうかを評価できます。

Q：メタゲノムおよびトランスクリプトミクス研究からのデータは、治療的または診断的開発のターゲットを提供しますか？

JP: はい、オミクスベースのアプローチはターゲットの発見を可能にする点に注意することが重要です。私たちは、戻ってメカニズムと機能に関する研究を行い、前臨床モデルを作成または活用して、なぜオミクスに基づく違いが存在するのか、そしてそれが疾患自体にどのように影響するのかを理解する必要があります。これらの研究からのデータは、潜在的な治療または診断候補を進めるための決定に役立ち、薬剤候補が微生物叢に影響を与えているかどうかに関する情報を提供します。

Q：2015年以降、顧客基盤はどの程度成長しましたか？

JP: 当社の顧客基盤は指数関数的に拡大しており、減速の兆候はありません。マイクロバイオームベースの治療法を創出し、進歩させている企業の数は急増しています。製薬会社は、ファーマコマイクロバイオミクスや、薬剤がマイクロバイオームによってどのように代謝されるかも採用しています。そのため、化学系薬剤の開発者でさえも、微生物叢によって修飾されるかどうかに関心を持っています。

Q：どのイルミナNGSシステムを使用していますか？

JP: iSeq−(* 100システム、MiSeq−(*システム2台、NextSeq−(* 500システム、HiSeq−(* 3000システム、NovaSeq−(* 6000システムがあります。ラボの立場から見ると、私たちは彼らを愛しており、彼らは私たちに多くの柔軟性を与えてくれます。

プロジェクトのリード長、データ、およびマルチプレックス要件によって、使用するパイプラインが決まります。iSeq 100システムは、新しいプロトコールの品質管理と検証に使用します。また、迅速なターンアラウンドでファージまたはスモールゲノムシーケンスプロジェクトを実施するためのコスト効率の高いツールも提供します。アンプリコンベースのシーケンスにはMiSeqシステムを使用しています。NextSeq 500、HiSeq 3000、およびNovaSeq 6000システムは、RNA-Seqおよびメタゲノムシーケンスの実行に使用されます。また、シーケンスライブラリーの構築に役立つさまざまなロボットハンドラーとエコー装置も検証しました。

Q：NovaSeq 6000システムはあなたの研究でどのように機能しましたか？

JP: NovaSeq 6000システムは最近追加され、さまざまなフローセルにより、プロジェクトで使用するシーケンスタイプに柔軟に対応できるようになりました。話しながら新しいバーコードが追加され、順調に進んでいます。NovaSeq 6000システム上でマルチプレックスできる能力は、私たちにとって大きな助けとなりました。今後もNovaSeqをより多くのアプリケーションに利用していきます。当社のシーケンサーにこの製品を追加できたのはとても嬉しいことです。

iSeq 100システムは、新しいプロトコールの品質管理と検証に使用します。また、迅速なターンアラウンドでファージまたはスモールゲノムシーケンスプロジェクトを実施するためのコスト効率の高いツールも提供します。

Q：シーケンス効率は重要ですか？

JP: 効率性は、Diversigenの成功に不可欠です。12～17人の経験豊かな小規模チームが、一次解析までサンプル取り込みに取り組んでいます。納期は数週間ではなく数日です。イルミナのNGSシステムでは、シーケンサーが常に稼働するように、事前にプロジェクトをスケジュールすることができます。

Q：CMMRとDiversigenにおける今後5年間の目標は何ですか？

JP: 成長を続けたいと考えており、CMMRプロジェクトの一部のために知的財産（IP）の開発に関心を持っています。CMMRでは、がん免疫療法や社会不安プロジェクトなどに携わり、複数の臨床試験を実施してきました。ベイラーとDiversigenのパートナーシップを通じて、診断と治療の開発に加わる追加の候補を明らかにするのに役立つコホートの構築に、これらの初期観察を適用する方法を特定したいと考えています。また、Diversigenは、開発されたテクノロジーとアナリティクスにより、IP主導型になることも望んでいます。

Q：NGSとイルミナのシーケンスシステムは、Diversigenのマイクロバイオーム研究の将来にどのように影響すると思いますか？

JP: 短期的には、アンプリコンシーケンスはコミュニティをプロファイリングする優れた方法です。16Sシーケンスから全ゲノムショットガンシーケンスへの移行は、シーケンスのコストが下がり、マルチプレックス化と解析の構築、および微生物コミュニティを効果的にプロファイルするためのバイオマーカーの発見が上達するにつれ、今後も継続するでしょう。

一般的な微生物叢プロジェクトの大きさを考えると、NovaSeq 6000システムの容量は、当社のビジネスを長期間維持します。商業事業が成長するにつれ、最適なターンアラウンドタイムをサポートする速度でマルチプレックスプロジェクトを維持できるように、2つ目のプロジェクトが必要になる場合があります。

この記事で言及されている製品とシステムの詳細はこちら：

NovaSeq 6000システム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html

iSeq 100システム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/iseq.html

NextSeq 500システム、* www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/nextseq.html

MiSeqシステム、www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/miseq.html

*NextSeq 500システムはNextSeq 550システムに更新されました。