細菌性薬剤耐性の原因を探る

はじめに

結核（TB）は、しばしば過去の疾患と考えられています。しかし、かつては“消費”として知られていたこの致死的な医療上の苦痛は、依然として世界の死因上位10位にランクインしています。世界保健機関（WHO）によると、2017年に1,000万人が結核と診断され、1. 600万人が結核により死亡しました。¹ 現在の主な原因は、4種の特定の抗菌薬の6カ月の治療計画に直面した場合でも、細菌が進化する能力にあることが原因です。このような治療は何十年も前から使用されており、多くの結核菌株は、かつてはイソニアジドやリファンピシンなどの効果的な第一選択薬に対しても耐性を示してきました。2017年、50万人以上の新規結核症例がリファンピシンまたはイソニアジドとリファンピシンの両方に耐性を示し、多剤耐性（MDR）を示し、この疾患を治療がはるかに困難にし、感染拡大の可能性がはるかに高まっています。²結核の感染拡大の早期発見と新しいMDR-TB株の効果的な同定は、この疾患との闘いに不可欠になりました。

Institut Pasteur de LilleのCenter for Infection and Immunityのフランス国立科学研究センター（CNRS）のシニアサイエンティスト兼研究ディレクターであるPhilip Supply博士は、キャリアの大半を結核菌マイコバクテリウム結核を引き起こす細菌の内部の研究に費やしてきました。最先端のシーケンスおよびゲノム解析サービスを提供するフランスのバイオテクノロジー企業、GenoScreenの科学コンサルタントとして、Dr. Supplyは新しいターゲットディープシーケンスアッセイ、Deeplex Myc-TBの開発を支援しました。このアッセイは高感度で正確であり、時間のかかる細菌培養を必要とせずに、臨床喀痰サンプルから直接薬剤耐性TB株を同定できます。

iCommunityは、MDR-TBの増大する問題、イルミナの次世代シーケンサー（NGS）システムが検出にもたらす価値、Deeplex Myc-TBアッセイの開発、MDR-TB株の検出とサイレントアウトブレイクの制限にどのように使用できるかについて、Dr. Supplyと話し合いました。

PhDは、Institut Pasteur de Lilleの感染症免疫センターのCNRSのシニアサイエンティスト兼研究ディレクターであり、GenoScreenの科学コンサルタントでもあります。

Q：結核の細菌ゲノミクスと分子疫学に興味を持ったきっかけは何ですか？

Philip Supply（PS）：キャリアの初期に、酵母遺伝学に関する非常に基本的な質問を学びました。私は、一般の人々に直接利益をもたらした何かを変えて研究を行いたいと考えていました。フランス北部のイルのInstitut Pasteurの研究室長に連絡し、結核の研究を勧めました。Institut Pasteur of Lilleは、カルメット・ゲラン桿菌（BCG）であるオリジナルの抗結核ワクチンが1世紀前に開発された場所であり、結核研究の広範な歴史があります。会話の中で、私は今日、結核の問題の範囲について多くのことを学びました。

Q：結核の根絶が困難なのはなぜですか？

PS：結核は、無症候性に伝染する伝染性疾患です。患者は、診断される前にかなり長い間、結核感染の明確な臨床徴候なしに生活することができます。そのため、疾患を適切に診断し、その伝播を追跡できることが非常に重要です。しかし、高いクローン性集団構造を含む細菌の特性により、集団における結核の伝播を追跡することは困難です。TB株の多様性が低いため、集団内の株とその広がりを追跡するための非常に精密な分子ツールが必要になります。得られたデータは、結核患者や接触したすべての人を特定するため、また流行を解明するために流行株の伝播を判断するために使用できます。

Q：現在、結核はどのように治療されていますか？

PS：結核は他の細菌感染症に比べて治療が非常に難しく、非常に厳しい治療レジメンを必要とします。最も簡単な経過は6カ月で、患者のTB株が現在の第一選択抗生物質に感受性を示す場合にのみ有効です。このレジメンでは、結核患者は2カ月間毎日4種類の薬剤を服用します。その後の4カ月間は、確実に治癒するために、これらの4つの薬剤のうち2つを継続して服用する必要があります。

残念ながら、これらの第一選択薬はかなり長い間使用されており、耐性菌株が発生しています。薬剤耐性株に罹患した患者は、より長く、さらに複雑なレジメンに直面します。これらの患者の治療には最長で2年かかり、5～7種類の薬は効率が悪く、副作用も多くなります。これは、治療の成功率と死亡率に影響します。

WHOは、毎年約50万人の新規患者がリファンピシン耐性結核またはMDR-TBに罹患していると推定しています。しかし、これらの患者の25%のみが診断を受け、それに応じて治療を受けています。この診断上のギャップは大きな問題です。²

"Deeplex Myc-TBアッセイは、細菌負荷を最小限に抑えながら臨床サンプルから抽出したDNAに直接適用できるため、培養の必要性を緩和し、解析を迅速化できます。"

Q：医師は、この病気の耐性株にかかっているかどうか、どのように知ることができますか？

PS：薬剤耐性結核株を同定する古典的な方法は、感染した患者から痰を採取し、培養で標本を増殖させ、得られた分離株の抗生物質感受性を検査することです。その菌株がイソニアジドやリファンピシンなどの第一選択の結核薬に耐性を示す場合、第二選択薬の存在下で増殖を検査するために追加の培養が行われます。このアプローチの難しさは、これらの細菌の増殖が非常に遅いことです。完全な診断が下されるまでに、最長で2カ月かかることがあります。

Q：MDR-TBと闘うための新しい薬剤はありますか？

PS：ここ数年、数種の新薬が発売され、MDR-TBの治療において大きな進歩を遂げました。ベダキリンは2012年に承認されました。残念なことに、私たちはすでにそれに対する抵抗が現れています。Delamanidは2014年に承認され、プレトマニドは米国で規制審査中です。

Q：Deeplex Myc-TBアッセイは、結核の薬剤耐性株をどのように同定しますか？

PS：Deeplex Myc-TBは、全ゲノムシーケンス（WGS）アッセイとは対照的に、ターゲットNGSベースのアッセイです。WGSアッセイは、TB株で発生するすべての変異の全体像を提供することができますが、アッセイの実行に必要な大量のDNAが問題になっています。WGSアッセイに十分な量のDNAを得るには、7～10日間のTB培養が必要です。これは、薬剤耐性結核株の同定を遅らせる可能性のある重大な限界です。

ターゲットシーケンス法に移行し、最初に結核菌の主要な薬剤耐性遺伝子ターゲットを増幅してからシーケンスしました。Deeplex Myc-TBアッセイは、細菌負荷を最小限に抑えながら臨床サンプルから抽出したDNAに直接適用できるため、培養の必要性を緩和し、解析を迅速化することができます。

スピードに加えて、ターゲットシーケンスアプローチのもう一つの利点はシーケンス深度です。ディープシーケンスは、研究者が薬剤耐性変異を確実に担持する系統の亜集団を捕捉できるので重要です。これらの亜集団が細菌集団の少数を占める場合でも、治療対象として選択されるため、患者に薬剤耐性を引き起こす可能性があります。Deeplex Myc-TBアッセイは、サンプルのわずか3%に相当する耐性変異を持つ細菌亜集団を検出できます。

Deeplex Myc-TBアッセイの成功のもう1つの重要な側面は、シーケンス結果の迅速で簡単な解析と解釈のために、完全にパラメーター化された自動化されたウェブアプリケーションの開発に成功することです。これにより、NGSの専門家ではない多くのユーザーがアッセイに簡単にアクセスできます。

図1：Deeplex Myc-TB Assay遺伝子ターゲットには、既知（赤色）および潜在的な（青色）抗結核薬耐性関連変異を検出するためのマーカーが含まれます。

Q：Deeplex Myc-TBアッセイで使用するマーカーをどのように選択しましたか？

PS：マーカーの選択は、結核菌における薬剤耐性の主なターゲットに関するこれまでの知識に基づいて行いました。18の遺伝子のマーカーセットを定義し、これらの遺伝子内に既知の薬剤耐性変異も含めました（図1）。

アッセイは簡単にスケールアップできます。デラマニドやプレトマニドなどの最近発売された薬剤のターゲットを含めるためにマーカーの数を増やす予定です。

Q：Deeplex Myc-TBアッセイによりMDR-TB株が発見されましたか？

PS：南アフリカの4つの州から、現在の分子技術を用いて、1,823のTB分離株が最初にイソニアジド耐性のみで同定されたTB陽性培養の研究を実施しました。 GeneXpert MTB-RIFアッセイやラインプローブアッセイなどです。³ これらの分離株のうち277株を無作為に選択し、リファンピシン耐性変異特異的アッセイでスクリーニングした後、Deeplex Myc-TBアッセイとMiSeqシステムを用いたWGSで広範な耐性パターンを評価しました。 送信、 進化しています 検査したサンプルの15%で、リファンピシン耐性を引き起こす特殊な変異が同定されましたが、これは現在のWHO承認の分子検査やその他の検査では捕捉されていません。さらに、イソニアジドと他の2種の第一選択薬に対する耐性を引き起こす変異を特定したため、分離株をすべての第一選択抗生物質に耐性を示すMDR-TB株として再分類しました。

また、これらの菌株のほとんどは同じ感染拡大の一環であることがわかりました。その結果、これらの菌株は国内のMDRサーベイランスから逃れていました。また、ベダキリン感受性の低下と関連する可能性のある6つの分離株に4つの異なる変異を特定しました。全く予想外でした。これらの患者は、この薬剤で治療されたとは考えられませんでしたが、その患者集団で耐性の推定徴候が現れました。

Q：ベダキリンに対する薬剤耐性は、どのように迅速に発生するのでしょうか？

PS：これは微妙な質問であり、この特定のケースでは、まだ決定的な答えはありません。当社の系統解析の結果から、これらの変異はMDR-TB患者のベダキリン治療のための国内の臨床アクセスプログラムの開始後に発生したことが示唆されています。同時に、ベダキリンと以前の抗結核薬であるクロファジミンとの間には交差耐性があることも分かっています。ベダキリン耐性に関連する主な遺伝子も、クロファジミン耐性に関連する主な遺伝子です。追加データにより、発見された変異がこのような交差耐性を反映しているか、または新薬の誤用の可能性を反映しているかがわかる可能性があります。

"...イルミナのNGSシステムは、変異検出のための高精度を提供することでもよく知られています。薬剤耐性変異を持つサンプル内の少数のTB集団も検出できる必要があるため、これは非常に重要です。"

Q：Deeplex Myc-TBアッセイは、古いテクノロジーでは同定できない変異をどのように同定できますか？

PS：Deeplex Myc-TBアッセイは、従来の分子法よりもはるかに多くの機能を提供します。主な結核薬剤耐性ターゲットを含む>10,000塩基対を増幅するため、より包括的です。13種類の抗結核薬または薬剤クラスに関連する変異など、薬剤耐性を対象としています。GeneXpert MTB-RIFやラインプローブアッセイなどの現在のテクノロジーでは、これには匹敵できません。

GeneXpert MTB-RIFアッセイはリアルタイムPCRに基づいており、結果が出るまでわずか2時間で完了します。しかし、リファンピシン耐性を引き起こす変異のホットスポットであるrpoB遺伝子の限られた領域のみを対象としています。そのため、新しい南アフリカのリファンピシン耐性株の同定を見逃しました。これらの株は、rpoBのこの領域外にある変異を保有しています。さらに、GeneXpert MTB-RIFアッセイはリファンピシン耐性のみを検出し、他の抗結核抗生物質に対する耐性に関する情報は提供しません。

ラインプローブアッセイでは、オンラインプローブのハイブリダイゼーションとともにPCRを使用します。これらのプローブには、一部の抗結核薬に対する一般的な耐性変異の限られたセットのみが含まれていますが、すべてではありません。

Oxford Nanoporeシステムは、より最近のテストを代表するWGSを使用して、より多くのターゲットをキャプチャーします。前述したように、WGSアッセイでは十分なDNA量を得るために培養ステップが必要です。したがって、システムは遅く、カバレッジ深度は通常低くなります。私たちが知っている限り、シーケンス精度のレベルはイルミナNGSシステムと比較して高くありません。これは、特にマイノリティ集団における変異の検出において、大きな限界となっています。

Q：国際機関はDeeplex Myc-TBアッセイを使用していますか？

PS：WHOは、結核薬剤耐性調査に当社のアッセイを使用しており、同組織の2018年テクニカルガイドで言及されています。⁴ WHO調査データの一部は、ジブチにおける結核薬剤耐性レベルのデータマイニングを含む、すでに発表されています。Djiboutiでは、培養は体系的に行われません。その結果、Deeplex Myc-TBアッセイは、培養を必要とせずに臨床サンプルに直接実行できるため、特に有用でした。DjiboutiのMDR-TBサーベイランス調査に加えて、WHOは他の国で結核薬剤耐性調査に当社のアッセイを使用しています。

" 近い将来、私は、NGSベースのターゲットアッセイとWGSアッセイが、WHOやその他の多くの保健機関によって大規模に使用されることを想定しています。"

Q：Deeplex Myc-TBアッセイをWHOテクニカルガイドに含めたことで、サーベイランスにNGSアッセイを使用する保健機関が増えましたか？

PS：サーベイランスや個々の患者の結核薬剤耐性の迅速な診断のために、当社のアッセイの使用が増えています。サーベイランスは、TB疫学の正確な全体像、つまり全集団における薬剤耐性の症例数と有病率を提供し、NGSベースのアッセイはここで大きな違いをもたらすことができます。WGSアッセイとターゲットNGSアッセイはどちらも、個々の患者の分離株から得られた遺伝子型情報に基づいて、患者集団における薬剤耐性の有病率に関する広範なデータを提供します。

ターゲットアッセイとして、Deeplex Myc-TBは臨床サンプルが得られた直後にほぼリアルタイムの状態で適用することもできます。そのようなアッセイは、患者の最も適切な治療に関する迅速な臨床判断のための関連情報を提供することができます。対照的に、WGSアッセイは、ゲノムワイドレベルで分離株の遺伝的関連性を正確に判断する利点があります。したがって、集団におけるアウトブレイク株の存在に関する貴重な情報も提供できる可能性があります。近い将来、私は、NGSベースのターゲットアッセイとWGSアッセイが、WHOやその他の多くの保健機関によって大規模に使用されることを想定しています。

Q：あなたとGenoScreenチームが、アッセイにイルミナNGSシステムを選択した場合、その理由は何ですか？

PS：当社は、MiSeq、NextSeq 500、MiniSeq、iSeq 100システムなどのイルミナNGSシステムと連携しています。なぜなら、これらのシステムは世界中で最も使用されているからです。アッセイを開発し、これらのプラットフォームで検証すれば、アッセイのより迅速で効率的な展開に有利になるため、重要な利点が得られます。これらのプラットフォームは、変異検出のための高精度を提供することでもよく知られています。これは、薬剤耐性変異を持つサンプル内の少数のTB集団さえも検出できる必要があるため、非常に重要です。

Q：Deeplex Myc-TBアッセイは、結核サーベイランスやその他の医療業務の開発途上国で有用であると思いますか？

PS：Deeplex Myc-TBアッセイが世界中で使用されている貴重なツールとなることを願っています。欧州の一部のセンターで現在使用されているほか、このアッセイはアフリカの2カ国、ベニンとルワンダで展開されています。来年初め、当社は他の発展途上国でこのアッセイを臨床的に評価するプロジェクトを開始します。この評価は、Foundation for Innovative New Diagnostics（FIND）と協力して実施されます。FINDは、特に低中所得国における結核診断のための新しいターゲットNGSベースのツールをテストするために、Unitaidから助成金を取得しました。

Q：NGSベースのTBアッセイがTBサーベイランスと診断に広く利用されるために克服すべき課題は何ですか？

PS：さまざまな国で分子生物学のインフラとスキルの開発を進める必要があります。NGSベースのDeeplex Myc-TBアッセイを使用するTBリファレンスセンターやラボの学習とトレーニングは、細菌培養ベースのアッセイの能力を構築するよりも簡単かもしれません。実際、後者は臨床サンプルに直接適用できる検査に不要な特別なバイオセーフティーインフラストラクチャを必要とします。Deeplex Myc-TBアッセイワークフローの技術的ステップを確認するオンサイトトレーニングをすでに準備しています。これにより、アッセイが十分に受け取られ、最も効率的に使用されるようになります。

もう1つの重点分野は、異なる変異の検出に基づくアッセイデータの解釈についてスタッフをトレーニングすることです。データ解釈を容易にするため、シーケンスデータの自動解析のための当社のウェブアプリケーションは、非常にユーザーフレンドリーな設計になっています。

Q：Deeplex Myc-TBアッセイの開発における次のステップは何ですか？

PS：Deeplex Myc-TBアッセイに新しいターゲットを追加して、最新のTB抗菌薬に対する耐性を検出するだけでなく、アッセイを他のマイコバクテリアにも拡大することを想定しています。ハンセン病の原因となるマイコバクテリウムであるマイコバクテリウム属のプロトタイプアッセイがあります。結核とは異なり、ハンセン病は過去の病気だと多くの人が考えています。珍しいことですが、アフリカ、ブラジル、インド、中国など、世界の一部の地域にまだ存在しています。ハンセン病アッセイのプロトタイプは、薬剤耐性を検出し、診断とサーベイランスでの使用に関連する遺伝子型株を特定します。このターゲットアッセイは、完全なゲノムをカバーしませんが、患者集団内を循環する系統のサブラインと薬剤感受性または薬剤耐性系統を区別することができます。