NGSはバイオマーカー探索に有用であることが証明されました

はじめに

ゲノミクスは生物医学のあらゆる分野に変革をもたらしてきましたが、DNAシーケンスががん研究ほど大きな効果をもたらした場所はありません。サイエンティストは、腫瘍を詳しく調べて、全く同じように見えるがん間の微妙な違いとあまり微妙ではない違いを同定し、がんの原因と異なる種類の治療に対する反応について詳細に学びました。Centre Georges-François Leclerc（CGFL）のラボマネージャーであるRomain Boidot博士は、数百人の科学者や臨床研究者のシーケンスリソースとして機能しています。

2012年以来、Boidot博士とCGFLはイルミナの次世代シーケンス（NGS）システムをがん研究に利用してきました。まずMiSeqシステムから始め、トランスクリプトームシーケンス（RNA-Seq）、クロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-Seq）を実施し、固形腫瘍の特性評価に遺伝子パネルを使用しました。2015年1月、彼らはNextSeq 500システムを追加し、より高い出力を得て、より深いシーケンスを実行しました。彼らの現在のプロジェクトの一つは、乳がん遺伝子発現バイオマーカーを分類して、治療と予後に影響を与えることを期待して、固形腫瘍を効果的に説明することです。

iCommunityはBoidot博士と話をし、CGFLで実施されたがん研究について、またMiSeqおよびNextSeq 500システムによるRNA-Seq、ChIP-Seq、エクソームシーケンスの実施により研究者ががんバイオマーカーを発見する方法について学びました。

Q：CGFLではどのような種類の遺伝子マーカー研究が行われていますか？

Romain Boidot（RB）：がん細胞だけでなく、免疫細胞に特異的な遺伝子も研究しています。RNA-Seqを使用して、どのタイプの免疫細胞またはTリンパ球サブタイプが腫瘍に浸潤しているかを検出します。RNA-Seqの利点は、腫瘍細胞と、腫瘍微小環境を形成する細胞を研究できることです。免疫療法反応の特定のマーカーを特定するために、30～40人のがん被験者のコホートで新しいプロジェクトを開始しています。

Q：NGSをラボ研究に統合したきっかけは？

RB：まず、がん遺伝子パネルを用いてサンプルを研究したいと考えました。MiSeqシステムを採用したのはフランスで初めてでした。システムに慣れ、ワークフローを理解し、研究をサポートするのに最適なライブラリー調製テクノロジーを決定するために時間が必要でした。DNAシーケンスを6か月行った後、RNA-Seqも試すことにしました。2013年初めに、MiSeqシステムでRNA-Seqの実行を開始しました。

Q：MiSeqシステムでどのようなシーケンスプロジェクトを実施しましたか？

RB：当初は、BRCA遺伝子と相同組み換え遺伝子で構成されるがん遺伝子パネルを用いたルーチン作業にMiSeqシステムを使用し、乳がんと卵巣がんに対する感受性を研究しました。

Q：2013年初頭にRNA-Seqに移行したきっかけは何ですか？

RB：最初のRNA-Seqランは、T-CD4リンパ球の分化に関する研究を含む免疫学研究プロジェクトのために実施されました。¹ 最終的にはMiSeqシステムランを実施する2つのプロジェクトがあり、非常にうまくいきました。NextSeq 500システムは、ランごとにより高い出力とより多くのリードを提供する能力のために取得しました。

“NextSeq 500システムは、ランごとにより高い出力とより多くのリードを提供する能力のために買収されました。”

Q：現在、NextSeq 500およびMiSeqシステムでどのような種類の研究を実施していますか？

RB：MiSeqシステムとNextSeq 500システムには相乗効果があります。最終的には、シーケンス領域のサイズとサンプル数に基づいて決定を行います。NextSeq 500システムでは、集学的解析、RNA-Seq、ChIP-Seqのためのエクソーム研究を定期的に実施しています。また、特に大規模な被験者コホートがある場合、パネルで使用します。MiSeqシステムで数回のランを実施するのではなく、MiSeqシステム 500システムで大量の被験者サンプルをランします。

MiSeqシステムでパネルのルーチンシーケンスを行います。がん遺伝子パネルと小さながん遺伝子セットから始め、現在は体細胞遺伝子パネルを使用しています。

Q：NextSeq 500システムの利点は何ですか？

RB：主な利点はリード深度です。MiSeqシステムでは、約1,200万～1,500万リードを取得します。NextSeq 500システムを実行すると、リード深度が4億リードに倍増します。

NextSeq 500システムは、MiSeqシステムよりもさらに深い深度を得るために大量のサンプルマルチプレックスを実施できるため、解析あたりのコストを削減します。これにより、実施できるRNA-Seqプロジェクトの数が増えました。結果をより早く得ることも、明らかな利点です。

Q：MiSeqシステムとNextSeq 500システムの間でデータ品質に違いはありますか？

RB：両方のマシンで高品質のデータを取得しており、非常に満足しています。データ品質は、当社の基礎研究とトランスレーショナル研究をサポートします。NextSeq 500システムのRNA-Seqのリード深度ははるかに高く、より多くの情報が得られます。現在、MiSeqシステムとNextSeq 500システムの間でがん遺伝子パネルのシーケンスを比較しています。すぐに結果が出るはずです。

“BaseSpace Onsite withパイプライン解析は、BWAまたはIsaacを問わず、NextSeq 500システムでエクソームを実行することができます。”

Q：NextSeq 500システムを定期的に使用するまでにどのくらいの時間がかかりましたか？

RB：NextSeq 500システムの設置は非常にうまくいきました。ほぼすぐに使い始めました。NextSeq 500システムでの最初のシーケンスランはRNA-Seqであり、結果は強力でした。システムは2015年1月に到着し、3月中旬に稼働し、2015年6月にRNA-Seqの定期的実施を開始しました。その後、システム上でChIP-Seqおよびエクソームシーケンスの実行を開始しました。

システムの操作方法を学ぶにあたり、ほとんどの時間はライブラリー調製に重点を置いていました。濃度を調整することで、最適な数のクラスターを取得し、シーケンス能力を最大限に利用できることに気づきました。

また、ソフトウェアシーケンスランのセットアップ方法も学びました。当社では、Prep Tabソフトウェアを含むBaseSpace Onsite Server*を使用して、ライブラリープールをシーケンスランに整理しています。

Q：BaseSpace Onsiteはシーケンスパイプラインにどのような影響を与えましたか？

RB：CGFLの研究者に、シーケンスを理解し、実行できること、そして彼らが私たちのラボを使用するための真の付加価値があることを示す必要がありました。BaseSpace Onsiteでは、Burrows-Wheeler Aligner（BWA）またはIsaacアライメントソフトウェアのいずれでも、パイプライン解析により、NextSeq 500システムでエクソームを実行できます。BaseSpace Onsiteがない場合、エクソームワークフローをできるだけ迅速に実行してこの品質を達成できるとは思いません。

Q：単一のプロバイダーから包括的なワークフローを得るメリットは何ですか？

RB：1社のプロバイダーと連携することで、問題のトラブルシューティングを支援する単一の窓口となります。包括的なワークフローにより、解析の継続性が得られます。このプロセスに慣れ親しむことができ、高品質の結果を得ることができます。

“現在、すべての臨床研究サンプルをNextSeq 500システム上で実行しています。これは、必要なエクソームサイズで多くのサンプルのエクソームシーケンスとパネルシーケンスを実行できるためです。”

Q：臨床研究におけるNextSeq 500システムの価値は何ですか？

RB：現在、すべての臨床研究サンプルをNextSeq 500システムで実行しています。このシステムは、必要なエクソームサイズで多くのサンプルのエクソームシーケンスとパネルシーケンスを実行できることから選択しました。がんの臨床研究では、被験者の同意を得て応用バイオマーカーの研究に重点を置いており、文献でまだ特定されていないバイオマーカーを発見することができます。

Q：イルミナのカスタマーサポートは役に立ちましたか？

RB：イルミナのカスタマーサポートは優れています。懸念が生じたら、迅速に対処します。

Q：NGSは、研究で使用しているがん遺伝子パネルの種類を変えましたか？

RB：NGSは、非常に強力で最先端の研究ツールへのアクセスを可能にし、研究の影響を高めるのに役立ちました。サンガーシーケンスでは、BRCA1とBRCA2のパネルをシーケンスしていました。NGSでは、BRCA1 、BRCA2 、および乳がんや消化器がんの素因と考えられる23を超える他の遺伝子で構成されるパネルをシーケンスします。これらのパネルを使用することにより、乳がんや卵巣がんの素因の研究対象に過ぎなかった遺伝子が、消化器がんの素因に影響を与える可能性があること、またその逆にも影響を与える可能性があることに気づきました。

Q：研究の次のステップは何ですか？

RB：次のステップは、エクソームシーケンスの実行を継続し、ターゲット免疫療法と従来の化学療法に対する新しい応答バイオマーカーを同定することです。また、循環DNAバリアントの解析を可能にするパネルを開発したいと考えています。NextSeq 500システムは、より深いリード深度を提供し、情報の閾値を決定できるため、これらの研究を可能にします。また、RNA-Seqを使用して、パラフィン包埋腫瘍組織の融合遺伝子とバリアントを研究します。

Q：これらの進歩はNGSによって達成できると思いましたか？

RB：私が論文を書いていた間は、サンガーシーケンスしか利用できないテクノロジーでした。2年間の配属開始時にCGFLに戻ったとき、その見通しは変わりませんでした。その後、部門間ミーティングに行き、イルミナのNGSシステムで何が現れ始めたかについて人々が話しているのを聞きました。ヨーロッパに初めて送られたMiSeqシステムを見たとき、当社の研究に価値を付加できることに気づきました。MiSeqシステムやNextSeq 500システムを使って、こんなに多くのことをできるとは想像もできませんでした。