小児がんにおけるがんパスウェイの新たな見解

はじめに

世界保健機関によると、白血病または血液細胞のがんは、小児や青年で最もよく見られるがんです。¹小児白血病は比較的まれな疾患ですが、このがんの治療選択肢は集中的で衰弱しています。ほとんどの患者さんは何らかの化学療法を受け、さまざまな標的薬、放射線、幹細胞療法を使用することもあります。これらの治療に対する患者の反応は大きく異なります。どの治療法が最も効果的かを判断するには、それぞれの疾患の根底にある遺伝的差異を理解することが必要です。

ミラノ大学ビコッカ校のTettamanti Research Centerの医学遺伝学者であるGianni Cazzaniga博士と彼の同僚たちは、小児白血病の分子基盤を研究しています。次世代シーケンサー（NGS）を用いて、疾患の発症に寄与する可能性のある遺伝子を同定し、患者の治療反応の不均一性に関する洞察を得ています。この情報により、医師はいつか、各患者に対して最も安全で効果的な治療法を選択できるよう支援したいと考えています。

Cazzaniga博士と彼のチームはMiSeqシステムを使用し、1300を超えるがん関連遺伝子の融合遺伝子とバリアント発現を検出するために設計されたターゲットパネルであるTruSight RNA Pan-Cancerパネルのベータテストに関与しました。Cazzaniga博士は、彼のチームが小児白血病の基礎にある遺伝要因について何を学んでいるか、そして疾患の進行と再発における融合遺伝子の役割についての現在の理解についてiCommunityと話しました。

Q：医学遺伝学、特に小児白血病に興味を抱いたきっかけは何ですか？

Gianni Cazzaniga（GC）：私は、トレーニングによって生物学者であり、さまざまな疾患の診断と治療に役立つため、医学遺伝学を専門とすることにしました。私の研究室はミラノ・ビコッカ大学の小児科の一部です。私たちの目標は、小児白血病の治癒率を向上させることです。現在、治癒率は約80%で、がんではかなり高いです。²しかし、治療は非常に積極的です。治癒率を100%に改善し、疾患治療を改善して毒性を軽減したいと考えています。

私は小児科分野と情緒的なつながりがあります。自分の仕事が子どもたちに役立つことは気に入っており、白血病の治癒率を向上させる方法を模索することに熱心です。白血病も興味深い疾患だと思います。当社は、新しい予後サブグループ、特に治療のためのターゲット化可能な病変の定義に重点を置いています。私たちは、新しい特定の薬剤のターゲットとなりうる遺伝子再構成を特定したいと考えています。最終的には、白血病の小児の疾患治療方法を大幅に改善し、再発リスクを低減したいと考えています。

Q：Tettamanti Research Centerで実施される研究の焦点は何ですか？

GC：Tettamantiは、小児白血病に焦点を合わせた診断研究を行うために25年前に設立されました。親団体や査読付き助成によって支えられています。私は1994年以来、ここで働いており、20年以上も前から働いています。当初は、1つの部屋で研究を行っていました。現在、1,300平方メートルの新しい研究センターがあります。

“NGSは、クローン性評価とMRDモニタリング、および遺伝子異常の検出に非常に有用なツールです。”

Q：小児白血病の発症の誘因は何か知っていますか？

GC：残念なことに、小児白血病の誘因は誰にもわかりません。これは、私たちが答えようとしている質問の1つです。化学品や放射能などの有毒な状況への曝露に主に焦点を当てた疫学研究がいくつかあります。子宮内でも起こる事象もありますが、潜伏期間が長いため、白血病を引き起こすには十分ではないと考えています。

小児白血病の原因の解明に加えて、白血病前状態や疾患の臨床症状発現前の体の状態の研究にも関心があります。私たちの研究室は、出生前の発生源の実証に貢献しました。^3-4 最近、素因の研究に多大な関心が寄せられています。白血病の素因となる遺伝子の多型や変異を示す研究がいくつかあります。⁵これは、遺伝子レベルで何が起こっているのかを理解する上でNGSが重要なもう一つの分野です。

Q：研究でNGSをどのように使用していますか？また、NGSによって発見できたものは何ですか？

GC：NGSは、再発リスクに関連する遺伝病変を定義するのに役立ちます。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）やマルチプレックスPCRなど、分子再構成を特定するさまざまな可能性を評価しました。私たちが見ている病変の数が増えているため、全ゲノムかターゲットかを問わず、NGSの存在を同定する最良のツールがNGSであると判断しました。

また、NGSによる微小残存病変（MRD）の検出にも関心があります。これは20年間当社が行ってきた研究であり、現在、すべての臨床プロトコルで主要な診断因子として使用されているツールを開発した4つのラボのうちの1つでした。^6-10 NGSを使用して、MRDを評価できるクローンターゲットを定義できると期待しています。

Q：NGSは小児白血病研究にどのような影響を与えましたか？

GC：NGSは、クローン性評価とMRDモニタリング、および遺伝子異常の検出に非常に有用なツールです。小児がんの診断と予後につながる可能性のあるさまざまな異常を定義するターゲットパネルの開発を目指しています。当社は、融合遺伝子（転座から）、遺伝子発現プロファイリング、およびNGSの変異パターンを定義し、疾患の遺伝的要因を同定するために取り組んでいます。NGSはターンアラウンドを迅速化し、これらのドライバーの検出を向上させます。

古い手法（細胞遺伝学、PCR、またはFISH）では何も発見できず、すでに知っていることをモニタリングするためにのみ使用できます。

Q：ラボではどのようなNGSワークフローを採用しましたか？

GC：3年前にEuroNGSと呼ばれるヨーロッパのコンソーシアムを設立し、再発を予測するクローン性評価と微小残存病変（MRD）モニタリングにおけるNGSのさまざまな可能性を検討しました。まず、解析のバイオインフォマティクス部分の開発から始めました。

次に、異なるラボ間で異なる遺伝子のタスクを分割するプロセスを作成しました。各ラボは、1つの遺伝子の特定のアプリケーションの開発を担当していました。次に、発見したことを共有し、他のラボが開発したアプリケーションを検証する計画を立てる検証フェーズに移行しました。2016年末までに、ターゲット検出の方法を確立したいと考えています。来年は、クローン性およびMRDリスク評価研究にNGSを使用することを目指しています。

また、単一ラボとして、ゲノムに見られる分子異常、再構成の定義にも取り組んでいます。私たちはDNAレベルで働き、その後、ターゲットRNAキャプチャーなどの新しいアプローチについて考え始めました。さまざまな手法を比較し、これらの手法を使用して研究プロトコルを開発する準備を進めています。

Q：融合遺伝子とは何ですか？また、どのように作られますか？

GC：融合遺伝子は、染色体転座または内部欠失の結果です。¹¹ 転座は、白血病で見られる最も一般的な分子再構成イベントです。白血病では、多くの異常があります。染色体のコピーは予想より多い場合もあれば少ない場合もあります。転座による主要な遺伝子再配列の結果として、患者は二倍体超または二倍体低値になります。転座が特定の遺伝子の過剰発現を引き起こすリンパ腫とは異なります。白血病では、融合は1つの遺伝子の半分と別の遺伝子の半分の間の再構成です。結果は主に2つの結果に限定されます。1つは異常な転写因子の形成、もう1つはキナーゼの活性化です。これらは、NGSを使用して理解しようとしている主なメカニズムです。私たちは、これらの遺伝子とは何か、どのように作用するかを発見したいと考えています。

Q：DNAシーケンスとRNAシーケンスはいつ使用するのですか？

GC：染色体転座は融合遺伝子の発生原因であるため、これらに関心があります。開始当時、ターゲットRNAアプローチは利用できませんでした。DNAから始め、暫定領域で発生する染色体転座のブレークポイントを定義するために取り組みました。このシステムを適用したところ、2つの大きな問題がありました。1つはシーケンス長でした。イントロンのカバレッジは、必要なほど良くありませんでした。影響を受けたいくつかのシーケンスでは適切なソリューションを設計することができず、これらの領域はまさにブレークポイントが発生した領域でした。2つ目の問題は、目的のブレークポイントを持つシーケンスがあっても、それらは反復シーケンスであるため、ゲノムへのアライメントが困難であったことです。ゲノムの異なる領域にマッピングされており、どの領域が適切な領域かを知るのは困難です。また、疾患のモニタリングに使用できるDNAシーケンスがある場合、異数性はDNAコピー数と細胞数を相関させる際に問題を引き起こす可能性があります。つまり、処理中に残った細胞の数は、それらの細胞のDNAを測定することではわかりません。また、その逆も同じです。

MiSeqシステムを他のテクノロジーと比較した後、MiSeqシステムに移行しました。エラー率が低く、高い再現性を提供します。

RNAシーケンス（RNA-Seq）は、融合遺伝子と染色体転座の結果を直接定義できるため、はるかに優れています。このプロセスにより関連性のある遺伝子をターゲットにすることで、転座のパートナーを同定することができ、これは大きな利点です。RNA-Seqでは、RNA量で遺伝子発現を測定することもできます。

Q：NGSの前に、融合遺伝子を研究するためにどのようなツールが使用されましたか？

GC：過去には、細胞遺伝学、PCR、またはFISHを用いて融合を研究していました。PCRを使用するには、融合遺伝子のパートナー遺伝子を知る必要があります。FISHを使用する場合、特に多施設研究では、物流上の問題があります。モニタリングできるものは、細胞を正しい方法で採取できるかどうかにかかっています。その場合は、破損した遺伝子を検出できます。しかし、分子アプローチを用いてパートナー遺伝子を同定する方法はまだありません。これらの古い手法では発見できず、すでに知っていることを監視するためにのみ使用できます。

Q：小児白血病の融合遺伝子を研究するためにRNAパネルを選んだ理由は何ですか？

GC：DNAから始めましたが、反復配列とプローブのカバレッジが低いため、成功しませんでした。融合遺伝子が関連している必要があることがわかっているので、RNAパネルに移動しました。そのため、融合遺伝子にはRNA分子があることは確かです。また、融合に関与する頻度が高い遺伝子がいくつか存在することも分かっています。これらの遺伝子がパネルにある場合、その遺伝子が何を行っているかがわかります。

Q：MiSeqシステムは融合遺伝子の研究をどのように可能にしますか？

GC：当社は比較的少数のグループであるため、コストやバイオインフォマティクス解析の点で大規模なシーケンスシステムにアクセスすることはできません。MiSeqシステムは適切な妥協であり、発見すべきものを発見することができます。これにより、私たちは自ら手法を開発し、正しいバイオインフォマティクス解析を実施することができます。

MiSeqシステムを他のテクノロジーと比較した後、MiSeqシステムに移行しました。エラー率が低く、高い再現性を提供します。過去のテクノロジーと比較して、MiSeqシステムでより多くの発見作業を行うことができます。異なる手法で、異なる方法で、私たちが行うことを1つのプラットフォームにまとめることができます。イルミナはシーケンサーにも特化しています。そのため、このテクノロジーに投資するのに適した選択となりました。

“RNA Pan-Cancer Panelのサンプル要件は小さく、サンプルのサイズや品質に関係なく簡単に解析を行うことができます。”

Q：TruSight RNA Pan-Cancer Panelは、どのようにサンプルを最大限に活用できますか？

GC：特に小児科研究では、小規模で、しばしば劣化した、または質の悪いサンプルを扱うため、できることが制限されています。RNA Pan-Cancer Panelのサンプル要件は小さく（10～100 ngのトータルRNAまたは20 ngのFFPE RNA）、サンプルのサイズや品質に関係なく、解析を簡単に実施できます。MiSeqシステムもスループットが比較的低いため、前向きな方法でRNA-Seqを使用したいと考えているため、当社にとって有益です。ターンアラウンドは速いため、研究を前進させるために、結果を確認し、迅速に発見しています。

Q：BaseSpace  RNA Coreアプリを使用してデータを解析する利点は何ですか？

GC：当社では、2つの異なる方法でデータを解析しています。当社のチームには、生物情報学者ではなく生物学者で、当社のRNAデータの解析にBaseSpace RNA Coreアプリを使用している人が1名います。彼女は、融合遺伝子の検出に十分な、解析可能な最小限の種類の情報を理解することができました。また、バイオインフォマティクスグループと協力し、独自の解析システムを開発しています。このグループの若いバイオインフォマティクス担当者が、共同研究者とのトレーニングを行っています。

Q：RNA-Seqを使用して、これまでにどのような興味深い発見を発見しましたか？

GC：関心のある1つの遺伝子であるPAX5遺伝子を含む新しい融合遺伝子を発見しました。^12-13 また、MiSeqシステムを使用して、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病の症例と共通して遺伝子発現シグネチャーを持つ予後不良の被験者の新しいサブグループにおける異常を定義しています。このグループ（Ph-like ALLと呼ばれています）は、t（9;22）転座と同様の表現型を持っていますが、実際の転座はありません。この特定のサブグループにおける分子イベントを定義し、何が起こっているかをよりよく理解できるようにしています。

Q：研究研究における次のステップは何ですか？

GC：NGSを使用してMRD評価を実施する予定です。私たちは、100,000個の正常細胞との関連で、1つの特定の分子、つまり1つの特定の白血病細胞を同定するための方法の感度を、可能な限り改善したいと考えています。検出限界を押し上げたいと考えています。また、白血病で見られる可能性のあるすべての分子異常についても引き続き研究していきます。患者さんに利益をもたらす全トランスクリプトームRNA-Seqをどのように適用できるかを理解できるように、発見をさらに進めたいと考えています。

Q：NGSとの仕事があなたをどこへ導くことを期待しますか？

GC： 発見が個別化医療に役立つことを願っています。将来的には、分子異常を評価し、患者のサブグループを同定するために使用できるNGS検査を開発し、臨床医が各患者の治療がターゲットにされ、個別化され、効果的であることを確認することができるようにしたいと考えています。¹⁴

この記事で言及されている製品とシステムの詳細はこちら：